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本文揭示 HSD17B4 缺陷影响原发性纤毛生成及相关信号通路，发现乙酸盐可改善相关缺陷，为相关疾病治疗提供新思路。
引言
原发性纤毛（Primary cilia）是存在于多种组织细胞表面的高度动态的感觉细胞器，在介导多种细胞外和细胞内信号通路中发挥关键作用，如声波刺猬（Sonic hedgehog，Shh）、转化生长因子 β（transforming growth factor β，TGF-β）和血小板衍生生长因子受体 α（platelet-derived growth factor receptor α，PDGFRα）信号通路，进而调节各种细胞过程。原发性纤毛生成（Primary ciliogenesis）受细胞外因素影响，而纤毛解体可由包括组蛋白去乙酰化酶 6（histone deacetylase 6，HDAC6）介导的微管蛋白去乙酰化等信号通路诱导。纤毛生成和功能的破坏与一系列人类疾病相关，这些疾病统称为纤毛病（ciliopathies），涉及多种组织和器官系统，临床表现多样。
近年来，研究表明过氧化物酶体参与将胆固醇运输到纤毛，建立了过氧化物酶体代谢与原发性纤毛之间的功能联系。过氧化物酶体在脂质代谢中至关重要，尤其是脂肪酸 β- 氧化，该过程由多个酶参与，可产生包括乙酰辅酶 A（acetyl-CoA）在内的多种代谢产物。HSD17B4 是过氧化物酶体 β- 氧化的关键酶，催化超长链脂肪酸（VLCFAs）分解及乙酰辅酶 A 生成。HSD17B4 缺陷会破坏过氧化物酶体 β- 氧化，导致乙酰辅酶 A 缺乏和代谢功能障碍，引发一种罕见的遗传疾病，患者和敲除小鼠会出现多种症状，且这些症状与纤毛病的表型相似，但 HSD17B4 缺陷与纤毛病之间的关系尚不清楚。
结果
- HSD17B4 缺失引发纤毛病样症状：研究人员对携带 HSD17B4 c.422_423delAG 突变的患者来源的原代真皮成纤维细胞进行检测，发现与对照成纤维细胞相比，HSD17B4 缺陷的成纤维细胞纤毛生成明显受损，表现为纤毛细胞数量减少和纤毛长度缩短。同样的现象也在 HSD17B4 敲低的视网膜色素上皮（RPE）细胞和 HSD17B4 敲除（KO）的 SH-SY5Y 细胞中观察到。此外，HSD17B4 缺失还改变了纤毛信号传导，包括 Smad 2/3 介导的 TGF-β 和 GLI2 介导的 Shh 通路。这些结果表明，HSD17B4 缺陷会破坏原发性纤毛生成并损害纤毛依赖的信号通路。
- 过氧化物酶体 β- 氧化失调损害原发性纤毛生成：在促进原发性纤毛生成的条件下，耗尽 HSD17B4 仍显著抑制纤毛生成，即使使用已知的原发性纤毛刺激剂处理也无法恢复。研究还发现，破坏其他过氧化物酶体 β- 氧化相关基因，如 ABCD1、ACOX1、TYSND1 和 HSD17B4，在血清剥夺条件下会显著损害原发性纤毛生成。这表明 HSD17B4 缺陷导致的过氧化物酶体 β- 氧化失调会破坏原发性纤毛生成，揭示了过氧化物酶体代谢与纤毛动力学之间此前未被认识的联系。
- 恢复乙酰辅酶 A 水平可挽救 HSD17B4 突变导致的原发性纤毛缺陷：通过使用包含约 550 种化合物的代谢物库进行高内涵细胞筛选，发现包括乙酰辅酶 A 在内的几种过氧化物酶体 β- 氧化终产物能有效挽救 HSD17B4 缺失细胞中的纤毛发育异常。研究证实，用乙酰辅酶 A 或乙酸盐处理可有效恢复 HSD17B4 缺陷细胞中的原发性纤毛生成。在 HSD17B4-KO 细胞和患者来源的成纤维细胞中，乙酰辅酶 A 水平显著降低，而乙酸盐补充可恢复其水平，并增强原发性纤毛生成。对于 HSD17B4 的功能缺失突变体（G16S 和 N457Y），乙酸盐补充同样能显著增强纤毛生成。这些结果表明，乙酸盐补充可挽救 HSD17B4 缺陷导致的原发性纤毛缺陷，突出了乙酰辅酶 A 在原发性纤毛生成中的关键作用。
- HDAC6 介导乙酰辅酶 A 诱导的 HSD17B4 缺陷细胞中的原发性纤毛生成：为探究 HSD17B4 缺陷诱导原发性纤毛生成失调的分子机制，研究人员用多种 HDAC 抑制剂处理 HSD17B4-WT 和 - KO 细胞。结果发现，HDAC6 选择性抑制剂 Tubastatin A 以及泛 HDAC 抑制剂如 TSA、VPA 和 SAHA 能显著挽救 HSD17B4-KO 细胞中的原发性纤毛生成缺陷。在 HSD17B4 缺陷的小鼠胚胎成纤维细胞（MEFs）中删除 HDAC6，几乎完全挽救了纤毛生成缺陷，且伴随着 α- 微管蛋白乙酰化的显著增加。这些结果表明，HDAC6 通过抑制 α- 微管蛋白乙酰化，在 HSD17B4 缺陷细胞中介导纤毛发育异常，响应降低的乙酰辅酶 A 水平。
- Hsd17B4 基因敲除导致小鼠出现纤毛病样病理特征：Hsd17B4 敲除（Hsd17B4?/?）小鼠在主要器官中完全缺失 Hsd17B4 表达，与野生型（Hsd17B4+/+）对照相比，表现出严重的生长迟缓和较高的死亡率。组织学分析显示，Hsd17B4?/?小鼠的肾脏和肝脏出现纤维化，大脑组织学显示小脑发育异常，包括小脑小叶不规则、大小减小、浦肯野细胞数量显著减少和分子层变薄。行为学测试表明，Hsd17B4?/?小鼠在 9 周龄时出现运动协调缺陷，这可能归因于小脑浦肯野细胞的丢失和原发性纤毛生成的显著减少。这些结果表明，Hsd17B4 缺陷导致生长迟缓和运动功能障碍，与原发性纤毛失调有关。
- 乙酸盐给药挽救 Hsd17B4 缺陷小鼠的纤毛病样缺陷：乙酸盐给药虽未改变 Hsd17B4?/?小鼠的出生率，但显著提高了其存活率。组织学分析显示，乙酸盐处理的 Hsd17B4?/?小鼠小脑大小增加，小叶形态恢复。功能上，乙酸盐处理显著改善了 Hsd17B4?/?小鼠的运动协调能力，恢复了小脑浦肯野细胞的数量和结构形态，增强了原发性纤毛生成，并恢复了关键的纤毛调节信号因子。同样，给予 HDAC6 选择性抑制剂 Tubastatin A 也产生了类似的效果。这些结果表明，乙酸盐给药通过恢复原发性纤毛生成和小脑功能，挽救了 Hsd17B4 缺陷小鼠的纤毛病样表型。
讨论
过氧化物酶体通过 β- 氧化在脂质代谢中与线粒体协同发挥关键作用，过氧化物酶体功能障碍与多种疾病相关，但过氧化物酶体与原发性纤毛之间的关系此前未明确。本研究发现，HSD17B4 缺失在多种模型中导致原发性纤毛生成缺陷，破坏纤毛相关信号通路。关键过氧化物酶体 β- 氧化酶的敲低同样损害原发性纤毛生成，且已知的纤毛诱导剂无法恢复 HSD17B4 缺陷细胞的纤毛生成。然而，乙酸盐补充可通过恢复乙酰辅酶 A 水平挽救原发性纤毛发育异常，野生型 HSD17B4 的重建可恢复纤毛生成，而 HSD17B4 错义突变体则无法挽救，表明过氧化物酶体 β- 氧化是调节原发性纤毛生成的关键代谢途径，但具体分子机制仍需进一步研究。
乙酰辅酶 A 是组蛋白乙酰化的关键调节因子，通过组蛋白乙酰转移酶（HATs）和 HDACs 调节基因表达。HDAC6 促进 α- 微管蛋白去乙酰化，导致原发性纤毛轴丝不稳定和解体，抑制 HDAC6 可防止纤毛解体并增强纤毛生成。本研究中，抑制 HDAC6 显著挽救了 HSD17B4-KO 细胞的原发性纤毛生成缺陷，HSD17B4 缺陷引发的原发性纤毛生成失调在 HDAC6 缺陷细胞中得到有效恢复。
此前研究表明，Hsd17B4 缺失会导致小鼠出现多种与纤毛病相关的特征，本研究观察到 Hsd17B4?/?小鼠出现肾和肝纤维化、运动协调受损和浦肯野细胞畸形，与原发性纤毛生成破坏有关。由于原发性纤毛对小脑浦肯野神经元的连接和存活至关重要，Hsd17B4 缺陷可能通过破坏代谢稳态导致纤毛生成缺陷。乙酸盐作为乙酰辅酶 A 的代谢前体，给药后有效恢复了 Hsd17B4?/?小鼠小脑的原发性纤毛生成及其相关信号通路，增加了浦肯野细胞数量，改善了结构完整性，缓解了运动功能障碍，进一步支持了乙酰辅酶 A 代谢在纤毛生成和神经功能中的作用。
尽管乙酸盐治疗通过促进微管蛋白乙酰化显著增强了原发性纤毛生成，但可能还有其他因素参与这一过程。近期研究表明，微管蛋白棕榈酰化可能发挥作用，且抑制脂肪酸合成在某些条件下可能促进纤毛恢复，这表明乙酰辅酶 A 代谢与纤毛生成之间的机制相互作用仍需进一步研究。本研究强调了细胞乙酰辅酶 A 水平在调节原发性纤毛生成中的关键作用，为 HSD17B4 相关疾病的治疗提供了潜在策略，但仍需进一步的临床前和临床研究来验证。
方法
- 试剂：研究中使用的多种试剂，如乙酰辅酶 A 钠盐、乙酸钠、多种 HDAC 抑制剂等，均购自不同的公司。
- 细胞系：通过 CRISPR/Cas9 技术构建 HSD17B4-KO 细胞系，同时使用来自患者和健康对照的成纤维细胞，以及 WT MEFs 和 HDAC6 KO MEFs，细胞在特定条件下培养。
- 基因敲低研究：设计并合成针对多个基因的小干扰 RNA（siRNAs），用于转染细胞进行基因敲低实验。
- 基于图像的代谢物库筛选：利用包含多种代谢物的粪便代谢物库，对细胞进行处理并在荧光显微镜下观察原发性纤毛，以筛选能影响纤毛生成的代谢物。
- 测量细胞内乙酰辅酶 A 水平：使用特定的检测试剂盒，按照说明书测量细胞和肝脏样本中的乙酰辅酶 A 水平。
- 动物和恢复试验：动物实验遵循相关指南并获得批准，使用 Hsd17B4 敲除小鼠，设置不同处理组，包括给予乙酸盐或 HDAC6 抑制剂 Tubastatin A，通过 rota-rod 测试评估小鼠运动功能。
- 免疫染色：对细胞和小鼠组织样本进行免疫染色，使用特定抗体标记原发性纤毛等结构，通过荧光或共聚焦显微镜观察并分析。
- 蛋白质免疫印迹：制备细胞和组织样本的裂解物，进行 SDS-PAGE 电泳、转膜，与特定抗体孵育，检测相关蛋白表达水平。
- 统计分析：使用 ANOVA 和 Tukey 多重比较检验或非配对双尾 t 检验对结果进行统计分析，数据以均值 ± 标准误（SEM）表示。
- 报告总结：研究设计的进一步信息可在相关的 Nature Portfolio Reporting Summary 中获取。
