编辑推荐：
为解决海藻酸盐裂解酶（ALs）分子反应机制不明问题，研究人员剖析 PL7 家族 ALs 机制，揭示反应类型及关键残基作用。
在广袤的海洋世界里，褐藻静静生长，其细胞壁中蕴含着一种神奇的物质 —— 海藻酸盐（Alginates）。这是一种线性阴离子多糖，由 β-D - 甘露糖醛酸（M）和其 C5 差向异构体 α-L - 古洛糖醛酸（G）组成。海藻酸盐在工业领域有着广泛的应用，在食品行业，它可以作为增稠剂、稳定剂，让酸奶、冰淇淋等食品拥有更好的口感和质地；在生物医药领域，它能用于药物递送、组织工程等方面，为人类健康贡献力量。据统计，每年全球从褐藻中提取的海藻酸盐及海藻酸寡糖约达 4.5 万吨，市场价值近 9 亿美元。
然而，海藻酸盐的酶促修饰机制一直是个未解之谜。海藻酸盐裂解酶（ALs）能够催化海藻酸盐的解聚，但由于缺乏催化活性的米氏复合物结构，人们对其分子反应机制知之甚少。这就好比一把锁，虽然知道有钥匙能打开它，但却不清楚钥匙的形状和开锁的具体方式。这种知识的缺失限制了人们对海藻酸盐和海藻酸寡糖的定制化生产，无法充分发挥它们在工业中的潜力。
为了揭开这个谜团，来自西班牙巴塞罗那大学、丹麦技术大学、挪威科技大学等多个研究机构的研究人员组成了一支强大的科研团队，开展了一项深入的研究。他们的研究成果发表在《Nature Communications》上，为我们理解海藻酸盐裂解酶的作用机制带来了新的曙光。
研究人员采用了多学科交叉的研究方法，其中包括单晶 X 射线衍射、中子衍射、核磁共振光谱（NMR spectroscopy）以及量子力学 / 分子力学（QM/MM）模拟等先进技术。这些技术就像是一套精密的工具，帮助研究人员从不同角度观察和分析海藻酸盐裂解酶的奥秘。
研究结果主要包括以下几个方面：
- 时间分辨产物形成：研究人员利用时间分辨 NMR 技术研究了来自海洋真菌 Paradendryphiella salina 的两种 PL7 家族成员 PsAlg7A 和 PsAlg7C 的作用模式和产物形成过程。结果表明，它们均为内切酶且对 M 块具有特异性，主要产生带有不饱和末端的三聚体或更高聚合度的寡聚体，这一发现为深入了解它们在海藻酸盐代谢中的作用提供了重要线索。
- 整体结构及与其他成员关系：通过解析 PsAlg7A 和 PsAlg7C 的晶体结构，研究人员发现它们与其他 PL7 成员相似，都具有 β- 果冻卷结构域。但它们与其他已解析结构的 PL7 成员不同，在结合裂缝的非还原端存在两个延伸的 β- 链，这一结构特征可能与底物结合和底物选择性有关。此外，研究还发现 PsAlg7A 和 PsAlg7C 的底物结合凹槽的电荷差异，能够解释它们对聚 M 的 Km 值和催化周转率的不同。
- 晶体内底物裂解及活性位点：研究人员成功地将 M 寡糖浸泡到 PsAlg7A 晶体中，实现了晶体内底物裂解，从而确定了 PL7 家族成员的 -1 和 +1 亚位点，这些亚位点决定了可裂解键的位置。而对 PsAlg7C 进行晶体内底物裂解的尝试未成功，不过在其突变体结构中发现了一些与底物结合相关的信息。
- 米氏复合物及底物识别：研究人员通过结晶获得了 PsAlg7A 和 PsAlg7C 的米氏复合物结构，发现其中存在复杂的氢键网络，这对于底物在活性位点凹槽中的容纳和识别至关重要。同时，研究还确定了一些在底物结合中起关键作用的氨基酸残基，这些残基的相互作用决定了底物的结合和酶的特异性。
- 活性位点结构保守性及突变影响：比较 PsAlg7A 和 PsAlg7C 的活性位点结构发现，它们在结合配体前后以及不同酶之间的活性位点变化较小。但突变会影响 β-D - 甘露糖醛酸部分的构象，例如 Y223F 突变会导致 R82 与糖的相互作用改变，H124N 突变会使 M 部分发生扭曲，进而影响酶的活性。
- 表面结合位点：在 PsAlg7C-H124N 的晶体结构中，研究人员发现了一个表面结合位点（SBS），虽然其对 PsAlg7C 的活性并非必需，但可能在底物结合和降解过程中发挥一定作用，具体功能还需进一步研究。
- 催化残基的质子化状态：通过中子衍射结构分析，研究人员确定了 Y220 是催化碱，在催化过程中从 +1 亚位点的糖类中提取质子，而 H124 在底物结合中起重要作用，但不参与催化反应，这一发现为阐明催化机制提供了关键信息。
- 产物复合物及底物构象：研究人员通过对产物复合物结构的分析，发现底物在糖苷键断裂后的结合模式，以及 Y223 和 Y220 与底物的相互作用。同时，通过 QM/MM 元动力学模拟确定了 +1 亚位点 M 部分的最稳定构象为4C1，且活性位点能够稳定与催化相关的底物构象。
- 反应机制：基于 QM/MM MD 模拟，研究人员揭示了 PsAlg7A 催化的反应是一个协同但高度异步的反应，反应过程中发生了质子转移和糖苷键裂解，过渡态具有碳负离子特征，且反应产物中存在低能量障碍的氢键。
研究结论和讨论部分指出，该研究首次报道了两种 PL7 家族 ALs 的高分辨率酶 - 底物复合物结构，确定了催化残基的质子化状态，揭示了反应机制。这一发现不仅解决了以往关于反应是协同还是分步的争议，还为其他 PL 家族的反应机制提供了参考。该研究为海藻酸盐裂解酶的工程改造提供了理论基础，有助于生产定制化的海藻酸寡糖，同时也为设计基于活性的探针来识别真菌和细菌分泌组中的海藻酸盐裂解酶开辟了新途径，在生物技术和生物医学领域具有重要的应用前景。
