Ninetails技术：基于神经网络的mRNA聚腺苷酸尾非腺苷修饰直接检测方法及其在治疗性mRNA研究中的应用

《Nature Communications》推荐语：针对mRNA聚腺苷酸尾(Poly(A))非腺苷修饰检测的技术空白，波兰国际分子细胞生物学研究所团队开发了基于卷积神经网络的Ninetails算法。该研究通过纳米孔直接RNA测序(DRS)技术，首次实现单分子水平检测C/G/U修饰，揭示TENT5聚合酶低保真特性及mRNA-1273疫苗尾动态修饰规律，为优化mRNA治疗剂设计提供新维度。

　　

在基因表达调控的精密交响乐中，mRNA的聚腺苷酸尾(Poly(A) tail)犹如指挥家的节拍器，掌控着转录本的命运——从核质转运、翻译激活到降解调控。传统观点认为这段3'端延伸是纯粹的腺苷酸(A)串联，但近年研究发现其中常混杂着胞苷(C)、鸟苷(G)和尿苷(U)等"不和谐音符"。这些非腺苷修饰如同分子密码，可能深刻影响mRNA稳定性与功能，尤其在COVID-19 mRNA疫苗等治疗性RNA领域，尾结构异质性直接关联药效持久性。然而现有TAIL-seq、FLAM-seq等技术受限于扩增偏倚，难以真实反映修饰谱式，亟需开发无需扩增的单分子检测方案。

针对这一技术瓶颈，波兰国际分子细胞生物学研究所(International Institute of Molecular and Cell Biology)的Natalia Guminska团队在《Nature Communications》发表了创新性研究成果。他们开发的Ninetails算法系统，首次将纳米孔直接RNA测序(Direct RNA Sequencing, DRS)与深度学习相结合，实现了对Poly(A)尾非腺苷修饰的高精度解析。这项工作不仅揭示了内源性mRNA尾修饰的生物学规律，更破解了mRNA-1273疫苗在细胞内动态修饰的密码，为下一代mRNA药物设计提供了关键质量控制维度。

研究团队运用多项关键技术：1）纳米孔直接RNA测序避免扩增偏倚；2）设计含特异性非腺苷插入的体外转录RNA作为训练集；3）开发基于Gramian角场(GAF)的信号转换算法处理纳米孔电流信号；4）构建轻量化VGG架构卷积神经网络实现93%分类准确率；5）整合nanopolish与tailfindR软件界定Poly(A)边界；6）使用Tent5a^Flox/FloxTent5c^-/-基因编辑小鼠模型验证酶学特性。

"卷积神经网络准确检测和分类非腺苷修饰"部分显示，Ninetails对A/C/G/U的分类准确率达93%，AUC值0.9367。通过对比FLAM-seq数据，发现传统方法会高估连续修饰频率，证实DRS在避免PCR假象方面的优势。特别值得注意的是，模型能区分电流特征高度相似的C/U修饰，这对解析TUT4/7介导的尿苷化调控机制至关重要。

"不同酶以特定频率将非腺苷掺入Poly(A)尾"章节揭示，大肠杆菌poly(A)聚合酶(PAP)在等摩尔NTP条件下产生70%修饰尾，而生理浓度ATP时不足20%。T7 RNAP双突变体(G47A+884G)较野生型减少50%错误掺入，为mRNA生产质控提供新标准。这些发现与已知PAP核苷酸结合口袋特性相符，证实了方法的生物学相关性。

在"Moderna mRNA-1273疫苗Poly(A)组成在靶细胞内动态变化"的突破性发现中，研究捕捉到疫苗尾结构的时空演变：原始mΨCmΨAG五聚体在巨噬细胞内被TENT5A重新腺苷化，同时伴随16.09%的修饰率提升（野生型vs Tent5a/c敲除细胞的5.06%）。有趣的是，部分读段显示五聚体未被去除即发生再腺苷化，暗示TENT5A可能优先识别特定尾结构。

"线粒体转录本和TENT5A/C靶标在巨噬细胞中富含非腺苷修饰"部分通过GO分析发现，修饰富集于三类mRNA：1）线粒体呼吸链组分（如mt-Co1，由mtPAP修饰）；2）先天免疫效应分子（如Lyz2、Fth1）；3）核糖体蛋白。时间进程实验显示，mRNA-1273接种24小时后，这些靶标的修饰频率随TENT5A表达升高而增加，72小时回落至基线，揭示动态调控关系。

最后，"不同细胞类型Poly(A)修饰谱比较"证实，B细胞修饰频率(2.1%)显著高于T细胞(1.2%)，而巨噬细胞虽尾长最长但修饰率最低(0.8%)。这种细胞特异性模式提示不同RNA尾加工酶的活性差异，可能反映免疫细胞功能分化需求。

这项研究通过多维度验证确立了Ninetails作为Poly(A)修饰分析的金标准。其核心价值在于：1）首次实现治疗性mRNA尾结构动态监测，为优化LNP递送系统提供参数；2）揭示TENT5家族聚合酶的低保真特性，拓展了对非经典腺苷酸化调控的认知；3）建立线粒体mRNA质量控制与尾修饰的关联；4）开发的开源工具可兼容Oxford Nanopore各代测序平台。正如作者强调，该方法将推动"理性设计mRNA治疗剂"时代的到来——通过精确调控尾修饰模式来定制药物半衰期，同时为癌症、神经退行性疾病等mRNA治疗新适应症的开发铺平道路。