SunTag-PE：一种模块化高效的基因组编辑系统，为基因治疗带来新希望

研究人员为解决 PE 临床转化难题，开发 SunTag-PE 系统，其编辑效率高且适用多种形式，助力临床转化。

　　基因编辑技术就像一把神奇的 “分子剪刀”，能精准地对基因进行 “剪裁” 和 “修复”，为治疗遗传疾病带来了无限可能。引导编辑（Prime Editing，PE）更是其中的佼佼者，它可以实现任何期望的碱基替换或局部插入 / 缺失，理论上能纠正大多数已知的人类遗传疾病相关突变。然而，理想很丰满，现实却很骨感。PE 效应器的全长（6.3-kb）超出了腺相关病毒（AAV）的包装容量（~4.8 kb），这就好比一辆小货车要装下远超它承载能力的货物，根本装不下。这一难题严重阻碍了 PE 的临床应用，使得它难以从实验室走向临床治疗的舞台。

为了攻克这一难关，来自重庆医科大学附属第二医院妇产科、武汉大学中南医院妇产科等多家国内研究机构的研究人员展开了深入研究。他们开发了一种模块化且高效的 SunTag-PE 系统，就像是为 PE 效应器找到了一个巧妙的 “分身术”，将其拆分成 GCN4-nCas9 和单链可变片段（scFv）连接的逆转录酶（RT），从而解决了 AAV 包装容量不足的问题。这项研究成果发表在《Communications Biology》上，为基因治疗领域带来了新的曙光。

研究人员在开展研究时，运用了多种关键技术方法。首先是细胞培养与转染技术，他们培养了人胚肾 293T（HEK293T）细胞系和 HeLa 宫颈癌细胞系，并通过转染技术将相关质粒导入细胞。其次，利用 GUIDE-seq 实验检测脱靶活性，评估编辑系统的安全性。此外，AAV 载体生产与转导技术用于将构建好的载体导入细胞，还有基因组 DNA 提取与 PCR、测序分析等技术，用于检测编辑效率和分析编辑结果 。

研究结果如下：

• N-1×GCN4 SunTag-PE 是最有效的配置：研究人员最初设计了 SunTag-PE2，将不同拷贝数的 GCN4 融合到 nCas9^H840A的 N 端或 C 端。通过在 HEK293T 细胞和 HeLa 细胞中进行实验，发现当 nCas9 的 N 端只有一个 GCN4 拷贝时，编辑效率最高。这一结果与以往认为 GCN4 拷贝数越多效率越高的观点相反，可能是由于相邻肽结合位点的空间位阻导致的。同时，研究还表明 SunTag 系统在 PE3 形式中同样可行，SunTag-ePE3 的编辑效率比 SunTag-ePE2 高 2 - 5 倍。
• SunTag-PE2 编辑效率高于以往的分裂式 PE：研究人员选取 N-1×GCN4-nCas9 配置的 SunTag-PE 进行深入研究。在 PE2 形式下，与经典融合 PE、MS2-PE 和 Split-PE 相比，SunTag-PE2 在 HEK3 位点的 CTT 插入编辑水平与经典融合 PE2 相当，但显著高于 Split-PE2 和 MS2-PE2，且没有增加插入缺失（indel）副产物。进一步研究发现，SunTag-PE2 的优势源于 GCN4-scFv 的富集作用。
• SunTag-ePE2 在内源和外源位点高效编辑：为提高 SunTag-PE2 的编辑效率，研究人员构建了 SunTag-ePE2，使用含有 3′ evoPreQ1 基序的工程化 pegRNA（epegRNA）。在四个内源基因组位点的测试中，SunTag-ePE2 安装 CTT 插入的效率比 SunTag-PE2 提高了 1.5 倍，且在所有测试位点都能高效安装期望的突变，编辑水平与 ePE2 相当，脱靶编辑水平也没有显著增加。在外源位点的实验中，SunTag-ePE2 的精确编辑效率也高于 ePE2。
• SunTag-ePE3 在不同细胞系中表现优异：与经典 ePE3、Split-ePE3 和 MS2-ePE3 相比，SunTag-ePE3 在 HEK293T 细胞中编辑水平与经典 ePE3 相当，且高于 Split-ePE3 和 MS2-ePE3；在 HeLa 细胞中，SunTag-ePE3 的编辑水平在多个位点高于经典 ePE3，脱靶编辑效率也极低。
• SunTag-PE 系统适用于其他 Cas9 直系同源物：研究人员构建了 SauCas9-SunTag-PE 和 FrCas9-SunTag-PE，验证了 SunTag-PE 系统的模块化特性。虽然 SauCas9 介导的编辑存在插入缺失频率较高的问题，但优化后的 FrCas9-SunTag-PE 能成功在 AKT1 基因中插入短序列，精确编辑效率较高，插入缺失频率较低。
• 双 AAV 载体递送 SunTag-ePE3 修复致病突变：研究人员构建了 HBB 突变细胞系，并用双 AAV 载体递送 SunTag-ePE3，成功修复了致病突变，编辑频率达到近 25.47%，而单独递送 pegRNA-ngRNA-scFv-RT 则未检测到期望的编辑。

研究结论和讨论部分指出，SunTag-PE 系统是一种高效且灵活的模块化分裂策略，适用于不同版本的 PE 和多种 Cas9 直系同源物。该系统的高编辑效率源于 GCN4-scFv 的富集作用和游离可溶性 RT 的协同作用。其模块化和灵活性为开发新版本的引导编辑器提供了便利，研究人员可以在保持 GCN4-nCas9 不变的情况下探索不同的 RT 或 pegRNA 参数。此外，SunTag-PE 系统解决了 PE 递送的难题，为基因治疗的临床转化奠定了坚实的基础，有望让更多遗传疾病患者受益。