基于光遗传学的内源性蛋白质降解系统 POT：精准调控蛋白质水平的新利器

为精准调控蛋白质丰度，研究人员开发 POT 系统，可光控降解内源性蛋白，助力细胞研究与治疗。

　　在细胞的微观世界里，蛋白质就像一个个忙碌的 “小工匠”，它们的数量和活性精准调控着细胞的各种功能，维持着细胞的稳定状态。一旦蛋白质丰度的调控出现异常，就如同工厂的生产秩序被打乱，各种疾病便会乘虚而入，像癌症、心血管疾病等。目前，调控蛋白质表达的方法，如 CRISPR/Cas9 基因编辑技术和 RNA 干扰（RNAi），虽有一定作用，但都存在明显的弊端。CRISPR/Cas9 和 RNAi 在 mRNA 水平调控蛋白质表达，不仅操作繁琐、耗时久，而且容易引发细胞的补偿效应，对那些存在异常翻译后修饰的蛋白质更是束手无策。而现有的蛋白质降解策略，像分子胶招募靶蛋白至 E3 泛素连接酶、蛋白水解靶向嵌合体（PROTACs）以及 Trim-Away 系统等，虽然能实现内源性、未修饰蛋白质的降解，却无法做到精确控制，剂量不稳定还会导致治疗效果不佳或产生副作用。因此，开发一种能够精准、快速调控内源性蛋白质水平的方法迫在眉睫。

浙江大学的研究人员勇挑重担，开展了一项意义重大的研究。他们成功开发出一种基于光遗传学的新型蛋白质降解系统 —— 肽介导的光控 Trim-Away（Peptidemediated OptoTrim-Away，POT）。这项研究成果发表在《Communications Biology》上，为蛋白质调控领域带来了新的曙光。

研究人员在这项研究中运用了多种关键技术方法。细胞实验方面，使用了多种细胞系，如 COS-7 细胞、A549 细胞、HeLa 细胞和 HEK 293T 细胞 ，通过细胞转染将构建的质粒导入细胞。检测分析技术上，利用活细胞成像观察蛋白质的动态变化，免疫荧光染色确定蛋白质的定位与共定位情况，免疫印迹法定量分析蛋白质水平。此外，还通过细胞迁移实验、凋亡检测、细胞活力检测等实验，探究蛋白质降解对细胞功能的影响。

下面来看看具体的研究结果：

1. 光控内源性蛋白质降解工具箱的开发：研究人员利用光诱导寡聚化的光感受器隐花色素 2（CRY2）变体 CRY2olig，与 E3 泛素连接酶 TRIM21 和靶向肽融合构建 POT 系统。实验表明，用 488nm 光照射转染 POT 的细胞，5 分钟内就能观察到 mCherry 标记的 POT 聚集体形成，2 小时内 mCherry 信号降低至 50.56±5.35% ，证明 POT 是一种强大的蓝光诱导蛋白质降解工具。以磷酸肌醇 3 - 激酶（PI3K）110α 为靶点的 POT-PI3K 模块，经蓝光激活后，能使内源性 PI3K 110α 形成离散聚集体，其与 POT-PI3K 的共定位显著增加，且 POT-PI3K 能诱导内源性 PI3K 110α 蛋白水平降低 43.27±8.59% ，同时降低 pAkt⁴⁷³/ 总 Akt 的比值，还能作用于 PI3K 家族的其他成员如 PI3K 110β。此外，蛋白酶体抑制剂（R）-MG132 可抑制 POT-PI3K 诱导的蛋白质降解，证实 POT 是通过 TRIM21 介导的蛋白酶体途径实现蛋白质降解的。
2. POT 介导的内源性蛋白质降解的光剂量依赖性和可逆性：通过荧光漂白恢复（FRAP）技术，用不同强度的 488nm 光照射表达 POT-PI3K 的 COS-7 细胞，结果显示光刺激区域的细胞内 mCherry 信号显著降低，且光剂量越大，蛋白质降解程度越高，表明 POT 介导的蛋白质降解具有光剂量依赖性。同时，研究发现 POT-PI3K 系统中 CRY2olig 的寡聚化具有可逆性。光照后在黑暗中恢复，细胞内聚集体数量会逐渐减少，30 分钟后基本恢复到最大程度。而且，黑暗恢复能使之前被蓝光降解的 PI3K 110α 和 POT-PI3K 蛋白水平得到补充，说明 POT 诱导的蛋白质降解过程可被光照剥夺完全消除，周期性光照有望更精细地调控细胞内蛋白质丰度。
3. 光诱导内源性 PI3K 110α 降解抑制癌细胞迁移并促进细胞凋亡：在 HeLa 细胞中进行伤口愈合实验，发现蓝光照射 48 小时后，表达 POT-PI3K 的细胞向伤口区域的迁移明显减少，与 PI3K 抑制剂 LY294002 处理效果相当，且这种抑制作用可被胰岛素（PI3K 激动剂）缓解。细胞活力检测显示，光照刺激的 POT-PI3K 表达细胞活力显著降低。此外，流式细胞术分析表明，蓝光照射 24 小时后，POT-PI3K 表达细胞的凋亡率显著增加，胰岛素处理可部分挽救这种凋亡，说明光诱导 PI3K 110α 降解能抑制癌细胞迁移、降低细胞活力并促进细胞凋亡。
4. 光诱导内源性 GPX4 降解促进铁死亡：以谷胱甘肽过氧化物酶 4（GPX4）为靶点构建 POT-GPX4 模块。免疫荧光染色显示，LED 阵列光照后，内源性 GPX4 与 mCherry 标记的 POT-GPX4 共定位增加。生化实验证实，蓝光照射 4 小时后，POT-GPX4 能使内源性 GPX4 蛋白水平降低 39.22±1.03% 。进一步研究发现，光照 POT-GPX4 转染的 HeLa 细胞后，细胞内谷胱甘肽（GSH）与氧化型谷胱甘肽（GSSG）的比值显著降低，细胞活力下降，伴随线粒体聚集物形成和活性氧（ROS）水平升高，表明 POT 诱导的内源性 GPX4 降解能促进细胞铁死亡。

在讨论部分，研究人员指出 POT 系统具有显著优势。其利用的肽序列可从文献、数据库或通过 AI 算法获取，能有效靶向多种内源性蛋白质。同时，POT 系统借助 E3 泛素连接酶 TRIM21 和光遗传学工具 CRY2olig，实现了蛋白质的快速、可逆降解，且降解过程具有光剂量依赖性。不过，POT 系统也存在一些局限性，比如其降解效能依赖于过表达的 TRIM21，可能会对细胞活动产生意外影响，而且 “诱饵” 肽与靶蛋白的结合亲和力也需要进一步优化。

总的来说，POT 系统为快速调控内源性蛋白质水平提供了一种创新且实用的解决方案。它简化了靶向序列的筛选过程，能直接在蛋白质水平发挥作用，有望用于解析细胞内复杂的信号通路，为靶向细胞治疗开辟新的道路，在生命科学和健康医学领域展现出巨大的应用潜力。