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为探究宏结构域蛋白功能，研究人员分析其体外活性，发现新催化活性，明确 PARG 在 ADPr-RNA 脱帽中的关键作用。
在生命的微观世界里，蛋白质和核酸的修饰如同精密的调控密码，影响着细胞的各种生命活动。ADP - 核糖基化（ADP-ribosylation）作为其中一种重要的修饰方式，长久以来一直是科研人员关注的焦点。它不仅参与蛋白质的翻译后修饰，近年来还被发现参与 RNA 的转录后修饰。
在蛋白质的 ADP - 核糖基化过程中，ARTD 家族的 ADP - 核糖基转移酶（ADP-ribosyltransferases），也被称为 PARPs，能够利用 NAD+作为底物，将 ADP - 核糖基团转移到目标蛋白质上，形成单（ADP - 核糖）（MAR）或聚（ADP - 核糖）（PAR）修饰。这些修饰广泛参与从 DNA 损伤修复到免疫反应、新陈代谢等诸多重要生理过程。然而，对于大多数 ADP - 核糖基化位点在修饰后对蛋白质功能的影响，人们还知之甚少。
与此同时，核酸也被发现是特定 PARPs 的底物，这进一步拓展了 ADP - 核糖基化的作用范围。为了维持细胞内 ADP - 核糖基化水平的平衡，存在两类能够逆转 ADP - 核糖基化的酶，即含宏结构域的蛋白（MDCPs）和 ADP - 核糖基水解酶（ARHs）。目前，虽然对一些水解酶的研究已经取得了一定进展，但对于这些水解酶在生物学层面的具体功能，以及它们之间活性的系统比较，仍缺乏深入了解。此外，许多含宏结构域的蛋白，由于尚未对其所有可能的 ADP - 核糖基化底物进行测试，其潜在的催化活性也未被完全揭示。
在这样的研究背景下，德国 RWTH Aachen 大学的研究人员开展了一项深入研究，旨在系统地探究人类宏结构域的催化活性。研究成果发表在《Communications Biology》上，为我们理解 ADP - 核糖基化的调控机制提供了新的视角。
研究人员运用了多种关键技术方法。在结构分析方面，借助 FoldSeek 工具对人类蛋白质组进行筛选，寻找潜在的宏结构域样折叠，进而发现新的宏结构域蛋白。通过蛋白质纯化技术，获取重组的含宏结构域蛋白和 ARHs，用于后续的活性测试。针对不同的 ADP - 核糖基化底物，分别进行蛋白质和核酸的 ADP - 核糖基化及水解酶测定实验，以此来评估各种酶的活性。在细胞实验中，采用 siRNA 转染技术敲低相关酶的表达，结合细胞裂解、免疫沉淀和 Western blot 等方法，分析细胞内 RNA 的 ADP - 核糖基化水平。
研究结果如下：
- 结构分析确定新成员：通过 FoldSeek 工具和系统发育分析，研究人员发现亮氨酸氨肽酶 3（LAP3）含有与其他已知 MDCPs 相似的宏结构域样折叠。尽管 LAP3 可能缺乏催化活性，但仍将其纳入后续分析。
- 宏结构域对不同蛋白底物的活性：研究人员纯化了多种重组蛋白，测试它们对不同 ADP - 核糖基化蛋白底物的水解酶活性。结果证实，PARP9macro1和 PARP14macro1对自动修饰的 PARP10 具有活性，PARP14macro2和 PARP15macro2能够有效水解自动修饰的百日咳毒素，这表明它们不仅能识别 ADP - 核糖基化修饰，还能主动参与修饰的逆转过程。
- 宏结构域对不同核酸底物的活性：在对 5’ADP - 核糖基化单链 RNA（ADPr-RNA）的研究中，发现除了已知的水解酶外，PARP9macro1和 PARP14macro1也具有 ADPr-RNA 脱帽酶活性。进一步研究发现，不同宏结构域对 ADPr-RNA 的活性存在差异，其中 PARG 和 MACROD2 的效率较高。
- PARG 是体外最有效的 RNA ADP - 核糖基水解酶：对 PARG 和 MACROD2 进行详细表征后发现，PARG 在体外对 ADPr-RNA 的催化效率极高，其周转数（kcat）约为 46.7 s-1，催化效率（kcat/Kapp）约为 8.59×106 M-1 s-1，远高于 MACROD2。此外，研究还发现 PARG 对 ADPr-RNA 的催化机制与对 PAR 的水解机制存在差异。
- PARG 是细胞中关键的 RNA ADP - 核糖基水解酶：在细胞实验中，通过敲低或抑制 PARG，发现其能显著增加 HEK293 细胞中 RNA 的 ADP - 核糖基化水平，这表明 PARG 在细胞内对 RNA 的修饰起着关键的调控作用。不过，不同细胞系对 PARG 抑制的反应存在差异。
综上所述，该研究揭示了特定宏结构域的催化活性，包括一些之前被认为无活性的结构域。研究拓展了哺乳动物 ADP - 核糖基水解酶的种类，明确了 PARG 在 ADPr-RNA 水解中的关键作用，以及其催化机制与 PAR 水解机制的差异。这些发现为深入理解 ADP - 核糖基化的调控机制提供了重要依据，也为未来开发针对特定酶的抑制剂、研究相关疾病的发病机制和治疗策略奠定了基础。同时，研究也指出了当前研究的局限性，如部分蛋白无法进行活性测试、体外实验与细胞内环境存在差异等，为后续研究指明了方向。
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