重磅发现！USP22—— 体细胞重编程的关键阻碍及潜在调控靶点

研究人员聚焦染色质，利用 CRISPR 技术筛选，发现 USP22 阻碍体细胞重编程为 iPSC，为提高重编程效率提供新靶点。

　　# 探秘细胞重编程：USP22 成为关键 “拦路虎”
在生命科学的奇妙世界里，细胞就像一个个神秘的小精灵，它们有着独特的 “成长轨迹”。科学家们一直渴望能操控细胞的命运，其中将体细胞重编程为诱导多能干细胞（iPSC）是一个极具潜力的研究方向。iPSC 就像是细胞中的 “万能钥匙”，它具有分化成各种细胞类型的能力，在再生医学、疾病建模等领域有着广阔的应用前景。然而，目前从人类成人体细胞（如成纤维细胞）生成 iPSC 的效率极低，甚至低于 0.1% ，这表明细胞内存在着一些 “内在障碍”，阻碍了这一神奇转变的发生。为了揭开这些障碍的神秘面纱，来自土耳其 Ko? 大学医学院等多个机构的研究人员展开了深入探索，相关研究成果发表在《Communications Biology》杂志上。

研究人员开展的是一项聚焦染色质的 CRISPR-Cas9 筛选研究。他们构建了一个靶向染色质相关基因功能域的 CRISPR-sgRNA 文库（Epigenetic Domain-specific Knockout Library，EpiDoKOL），对可能影响重编程的染色质因子进行筛选。研究结果发现，泛素特异性肽酶 22（Ubiquitin-specific peptidase 22，USP22）是人类 iPSC 衍生过程中一个基于染色质的关键障碍。抑制 USP22 能够显著提高重编程效率，而且这一效果可能与 USP22 的去泛素化酶活性及其与 SAGA（SPTADA-GCN5 acetylase）复合体的关联无关。

在技术方法上，研究人员主要运用了以下关键技术：一是构建 EpiDoKOL 文库，设计针对染色质修饰酶催化或关键结构域的 gRNA；二是利用慢病毒转导和质粒转染技术，将相关载体导入细胞，实现基因编辑和重编程；三是通过免疫染色、流式细胞术等检测细胞的重编程效率和相关蛋白表达；四是运用 RNA 测序（RNA-seq）分析基因表达变化，以及进行蛋白质印迹（Western blot）实验检测蛋白水平。

下面详细来看研究结果：

1. EpiDoKOL 筛选确定 USP22 为阻碍因子：研究人员利用 EpiDoKOL 文库，在 DOT1L 抑制剂存在的条件下对人成纤维细胞进行筛选。通过 MAGeCK 算法分析筛选数据，发现靶向 DNMT3A、PAXIP1、EP300 和 USP22 的 gRNA 在 TRA-1-60 阳性细胞中显著富集。进一步验证发现，针对 USP22 的多个独立 gRNA 能显著提高重编程效率，证实了 USP22 是体细胞重编程为多能性细胞的重要障碍。
2. USP22 的催化活性并非阻碍关键：为探究 USP22 的阻碍作用是否依赖其去泛素化酶活性，研究人员进行了遗传拯救实验。在 USP22 基因敲除（KO）细胞中过表达野生型或催化失活的 C185A 突变体 USP22 cDNA。结果发现，野生型和 C185A 突变体都能抑制 iPSC 的形成，挽救 USP22 KO 细胞重编程效率增加的表型，说明 USP22 在阻止重编程中具有不依赖其催化活性的作用。
3. USP22 与 SAGA 复合体关联对重编程影响不大：研究人员通过对 USP22 的 K129R（乙酰化缺陷）或 K129Q（乙酰化模拟）突变体进行实验，发现它们都能挽救 USP22 KO 表型，表明 USP22 与 SAGA 复合体的结合调节不太可能在阻碍重编程中起重要作用。同时，敲除 SAGA 去泛素化酶模块的关键成分 ENY2 和 ATXN7L3，以及 USP22 的竞争去泛素化酶 USP27X 或 USP51，结果显示 ATXN7L3 敲除对重编程效率无影响，ENY2 敲除完全阻断 iPSC 生成，而 USP27X 和 USP51 敲除不影响重编程，进一步表明 USP22 作为重编程障碍的作用与 SAGA 复合体关系不大。
4. USP22 对维持多能性并非必需：研究人员对 USP22 敲除的 iPSC 克隆进行研究，发现 USP22 的缺失不影响 iPSC 的生成和自我更新。在胚胎体形成实验中，USP22 KO 克隆在第 6 天保留了更高水平的未分化状态标记 POU5F1 和 SOX2，且一个克隆未能强烈激活中胚层和内胚层标记 TBXT、EOMES 和 SOX17，但仍能形成包含三个胚层细胞的畸胎瘤，说明 USP22 对人类 iPSC 的自我更新不是关键的，且在分化过程中可能对多能性基因有抑制作用。
5. USP22 缺失促进重编程机制：研究人员发现，USP22 缺失不会改变成纤维细胞在重编程前后的增殖速率，也不影响重编程早期 TRA-1-60 阳性细胞的数量。通过 RNA 测序分析发现，USP22 缺失导致重编程过程中 226 个基因上调，442 个基因下调。下调基因主要涉及上皮 - 间充质转化（EMT）、细胞外基质、细胞粘附和细胞运动等相关基因集，表明 USP22 在维持体细胞身份中起作用；上调基因则包括细胞周期相关基因、凋亡、上皮发育和细胞骨架组织相关基因，以及多能性相关转录因子的靶基因，如 SOX2、SALL4、MYC 和 NANOG 等。此外，在幼稚培养条件下，USP22 KO 细胞生成的 Tra-1-60 和 KLF17⁺集落比对照成纤维细胞多两倍，且表达幼稚标记如 DPPA5、ALPPL2、KLF17，同时下调 primed 标记如 CD24 和 DUSP6，说明 USP22 缺失在 primed 和幼稚条件下都能增强重编程。

研究结论和讨论部分指出，该研究不仅证实了此前已知的重编程障碍，如 DNMT3A 和 EP300，还发现了 USP22 这一新型重编程障碍。USP22 可能是人类体细胞重编程的物种特异性障碍，其作为重编程障碍的作用不依赖于去泛素化酶活性和与 SAGA 复合体的关联，具体机制还需进一步研究。此外，USP22 对人类多能干细胞的多能性和自我更新并非必需，但在分化过程中对多能性基因有潜在抑制作用。这些发现为深入理解体细胞重编程机制提供了新视角，也为提高重编程效率提供了潜在靶点，有望推动再生医学等领域的发展。