线虫生殖细胞基因表达的时空单细胞架构研究成果显著

为探究精子发生机制，研究人员对秀丽隐杆线虫精子细胞进行研究，构建基因调控网络，意义重大。

　　

一、研究背景

在生命科学的微观世界里，精子发生是一个神秘而又至关重要的过程，它就像一场精密编排的 “分子舞蹈”，涉及众多基因表达的精准调控。秀丽隐杆线虫因其独特的生物学特性，成为研究精子发生的理想 “小助手”。它身体透明，生殖细胞丰富，约占总细胞数的三分之二，且精子发生过程在进化上较为保守。同时，它还是自体受精的雌雄同体生物，在第四幼虫阶段（L4），生殖细胞会先后分化为精子和卵子，这为科学家们研究精子干细胞分化和减数分裂等基本生物学过程提供了绝佳的平台。

尽管科学家们对精子发生已经有了一定的了解，但这个过程的发育轨迹和调控机制仍如同隐藏在迷雾之中。之前的研究主要集中在分离性腺、解剖性腺切片或提取生殖细胞核来研究基因表达，这些方法存在一定的局限性。随着单细胞测序技术的发展，虽然有研究对 L2 阶段的细胞进行了单细胞测序，但 L2 阶段生殖细胞刚开始增殖，无法涵盖生殖细胞完整的发育过程。而利用单细胞 RNA 测序（scRNA-seq）研究成年秀丽隐杆线虫神经元发育和衰老的研究，又未涉及精子发育。因此，对于精子发生过程中基因表达的时空变化及其转录调控的研究还十分有限，这就促使科学家们开启了新的探索之旅。

二、研究概况

为了揭开精子发生的神秘面纱，浙江大学生命科学学院、西湖大学等多个研究机构的研究人员展开了深入研究。他们以秀丽隐杆线虫为研究对象，利用高精度的 scRNA-seq 技术，对 L4 阶段的生殖细胞进行研究，旨在构建精子细胞的基因调控网络，揭示精子发生的分子机制。这项研究成果发表在《Cell Discovery》杂志上，为生殖生物学领域带来了新的曙光。

研究人员主要运用了以下关键技术方法：首先，通过 CRISPR/Cas9 技术构建了荧光标记的秀丽隐杆线虫品系，以便特异性地标记生殖细胞。接着，利用密度梯度离心和荧光激活细胞分选（FACS）技术富集和分离单个活的生殖细胞。然后，对这些细胞进行 scRNA-seq，获得转录组数据。之后，运用生物信息学方法对数据进行处理和分析，包括细胞聚类分析、差异表达基因（DEGs）鉴定、伪发育轨迹分析、转录因子（TFs）共表达网络构建等。此外，还通过磷酸化蛋白质组学分析、RNA 干扰（RNAi）实验等技术手段，深入探究基因调控的分子机制。

三、研究结果

1. 单细胞转录组分析：研究人员成功获得了 13949 个单细胞转录组，通过细胞聚类分析，将细胞分为生殖干细胞、卵原细胞和精原细胞三类。进一步分析发现，这三类细胞具有不同的基因表达特征，如生殖干细胞的基因高度差异表达与核糖体生成相关，卵原细胞的差异表达基因富集于卵子发生等过程，精原细胞的则主要与男性配子生成和蛋白质修饰相关。同时，还鉴定出了一些潜在的新标记基因，并通过实验进行了验证。
2. 精子细胞亚群鉴定：对精原细胞进行 t - 分布随机邻域嵌入（t-SNE）分析，发现了五个转录上不同的精子细胞亚群（SP1 - 5）。这些亚群在精子发生过程中具有不同的功能，早期阶段主要受转录和翻译过程控制，后期则主要由蛋白质翻译后修饰（PTM）调控。例如，SP3 亚群中与蛋白质靶向内质网相关的基因高度表达，SP5 亚群中有多个与精子细胞分化相关的差异表达基因。
3. 精子发生的动态调控：通过伪发育轨迹分析，发现精子发生是一个渐进的单向分化过程。研究人员还鉴定出了 3163 个在伪时间上动态表达的基因，并将其分为七组。分析 TFs 与这些基因的共表达网络发现，早期精子发生需要更多种类的 TFs 来启动各种细胞过程，而后期则涉及较少的 TFs。
4. TFs 对激酶和磷酸酶的调控：研究发现，随着精子发生的进行，磷酸酶和激酶转录本在总细胞转录本中的比例逐渐增加。构建的共表达网络显示，TFs 与磷酸酶、激酶之间存在复杂的调控关系。例如，TF NHR-23 被预测可调节 74 种磷酸酶，抑制 NHR-23 会导致潜在调节的磷酸酶表达显著下降。
5. NHR-23 对精子发生的影响：通过磷酸化蛋白质组学分析，发现 NHR-23 在精子发育后期显著表达，其敲低会导致不育。进一步研究表明，NHR-23 通过调节磷酸酶 W03F11.4 参与精子发生细胞分裂过程，W03F11.4 的表达降低会影响精子细胞的形态和功能，导致生育异常。
6. TFs 对小 RNA 通路的调控：研究发现，在精子发生过程中，piRNA 通路、内源性 siRNA 22G 通路和 miRNA 通路的成分转录本丰度逐渐下降，而 26G 通路成分的表达则逐渐增加。构建的共表达网络鉴定出了参与不同小 RNA 通路调控的 TFs，如 CEY-2 参与 piRNA 通路和 miRNA 通路的调控。
7. ELT-1 对 26G 通路的调控：研究表明，TF ELT-1 可调节 26G 通路中 Argonaute 蛋白 ALG-3/4 的表达。抑制 ELT-1 会导致 ALG-3/4 表达下降，进而影响 26G RNA 的丰度，最终影响精子的激活和功能，说明 ELT-1 在维持 26G RNA 通路和确保男性生育能力方面起着关键作用。
8. 开发交互式网络工具：研究人员开发了一个交互式、用户友好的网络工具 CelegansGermAtlas，方便研究人员探索秀丽隐杆线虫精子发生过程中基因的时空表达模式，以及 TFs 与调控基因之间的潜在关系。

四、研究结论与意义

这项研究通过对秀丽隐杆线虫精子细胞的单细胞转录组分析，构建了精子发生过程中的基因调控网络，揭示了精子发生的时空基因表达特征和调控机制。研究发现，精子发生是一个连续且渐进的过程，不同阶段的基因表达既具有独特性又存在重叠。TFs 在精子发生过程中起着关键的调控作用，它们通过调节磷酸化信号通路和小 RNA 通路等，影响精子细胞的分化和成熟。

此外，研究人员还发现了一些新的标记基因和潜在的调控因子，为进一步研究精子发生提供了新的靶点。开发的网络工具 CelegansGermAtlas 为研究人员提供了一个便捷的平台，有助于深入探索生殖细胞分化和繁殖的分子机制。这些研究成果不仅丰富了我们对精子发生的认识，也为生殖生物学领域的研究提供了重要的参考，为解决生殖相关疾病等问题奠定了理论基础。但研究也存在一些局限性，如在生殖细胞分离方法上还有待进一步优化，对于基因转录和蛋白质表达之间的差异等问题还需要深入研究。未来，随着技术的不断发展和研究的深入，相信会有更多关于精子发生的奥秘被揭开。