跨高尔基体网络拴系因子调控 TBK1 运输并促进 STING-IFN-I 通路的关键发现

为探究 TBK1 如何转运至 TGN 激活 STING-IFN-I 信号通路，研究人员发现 TGN 拴系因子不可或缺，这对理解衰老相关免疫变化意义重大。

　　在人体的免疫系统中，存在着一套精密的防御机制，其中 cGAS-STING 通路（环鸟苷酸 - 腺苷酸合成酶 - 干扰素基因刺激蛋白通路）起着至关重要的作用。它就像人体的 “安全卫士”，能够识别细胞质中的 DNA，对微生物入侵和细胞损伤进行监测，从而激活先天免疫反应。当该通路被激活时，STING 会招募 TBK1（TANK 结合激酶 1），进而磷酸化 IRF3（干扰素调节因子 3），诱导 I 型干扰素（IFN-I）的表达，这对于宿主防御和抗肿瘤免疫至关重要。然而，目前对于 TBK1 是如何运输到跨高尔基体网络（TGN）进行激活的，人们了解得还很少。同时，STING 下游的 IFN-I 和 NF-κB（核因子 κB）信号在衰老过程中的差异调节机制也不清楚。

为了深入探究这些问题，来自四川大学华西第二医院、浙江大学生命科学研究院等研究机构的研究人员展开了相关研究。他们的研究成果发表在《Cell Discovery》上，为揭示免疫反应的调控机制提供了重要线索。

研究人员在研究过程中运用了多种关键技术方法。在动物实验方面，构建了 Tbc1d23 基因敲除小鼠模型，用于在体内研究 TBC1D23 对 STING-IFN-I 信号通路的影响；细胞实验上，通过免疫印迹分析（Western blot）检测蛋白表达和磷酸化水平，利用免疫荧光和活细胞成像技术观察蛋白的亚细胞定位和动态变化，采用定量实时 PCR（qPCR）检测基因表达水平。

研究结果如下：

1. 氧化应激促进衰老过程中多个 TGN 拴系因子的减少：研究人员分析了年轻和老年小鼠多个组织中 TGN 拴系因子的蛋白水平，发现老年小鼠多个组织中，如 golgin-97、golgin-245、TBC1D23 和 FAM91A1 等多个 TGN 拴系因子的蛋白水平显著下降，但 GCC88 没有明显变化。在细胞实验中，用依托泊苷（etoposide）和 H₂O₂诱导原代小鼠肺成纤维细胞衰老，结果显示衰老细胞中 Arl1、golgin-97 和 golgin-245 减少，而 GCC88 未减少，且抗氧化剂 N - 乙酰半胱氨酸（NAC）可挽救这种减少。通过共聚焦荧光成像分析不同 TGN 拴系因子对氧化应激的反应，发现 Golgi 蛋白对氧化应激的敏感性不同，这解释了为什么在衰老或氧化应激时只有某些 TGN 拴系因子减少。
2. 多个 TGN 拴系因子促进 STING-IFN-I 信号通路的激活：研究人员选用溴苯（bromobenzene）和四氧嘧啶（alloxan）处理小鼠建立氧化应激模型，发现经 STING 激动剂 DMXAA 处理后，模型小鼠的 IFN-β 水平显著降低，但 IL-6 水平无明显变化。在细胞实验中，用 H₂O₂预处理细胞后再用 STING 激动剂 diABZI 处理，发现 H₂O₂预处理抑制了 TBK1、STING 和 IRF3 的磷酸化以及 IFNB1 的 mRNA 水平。在 THP-1 细胞中建立可诱导的多个拴系因子缺失模型，发现除 golgin-97 外，其他拴系因子缺失会显著抑制 IFNB1 的表达，而对炎症因子 TNF-α 的表达影响不大。此外，敲低 WASH 复合物亚基 FAM21 也会抑制 IFNB1 的表达。
3. Tbc1d23 基因敲除小鼠主要损害 STING-IFN-I 信号通路：研究人员构建了 Tbc1d23 基因敲除小鼠，给敲除小鼠和对照小鼠注射 MnJβ 佐剂或 DMXAA 后发现，敲除小鼠的 Ifnb1 mRNA 水平、血清中 IFN-β 蛋白水平以及 Ifit2 的 mRNA 水平均显著降低，而 IL-6、IL-1β 和 TNF-α 的表达无明显差异。在骨髓来源的巨噬细胞（BMDMs）实验中也得到了类似结果，且敲除 Tbc1d23 显著损害了 TBK1、STING 和 IRF3 的磷酸化，但对 p65 的磷酸化水平影响不大。
4. TBC1D23 促进 TBK1 的转运和激活：通过共转染实验和活细胞成像，研究人员发现 TBK1 与早期内体标记物 RFP-FYVE、晚期内体标记物 RFP-CD63 共定位，且与 FAM21 共定位。敲低 Tbc1d23 会阻碍 TBK1 从内体向重细胞器的转运，抑制 TBK1 在高尔基体的激活。此外，研究人员通过构建 TBK1 突变体 TBK1 L693Q，发现其与膜的结合能力降低，STING 信号通路的激活也受到抑制。利用基于 FKBP-FRB 系统的雷帕霉素诱导内体靶向方法，进一步证实了内体定位的 TBK1 对 STING 信号通路的重要性。
5. TBC1D23 通过 FAM21 与 TBK1 相互作用并调节 STING-IFN-I 信号通路：免疫沉淀实验表明，FAM21 能与 TBK1 和 IRF3 相互作用，TBC1D23 也能与 TBK1 共免疫沉淀，且这种相互作用在 diABZI 处理后略有增加。TBK1 L693Q 与 TBC1D23 的相互作用减弱，FAM21 缺失会强烈破坏 TBC1D23 与 TBK1 的结合，表明 FAM21 介导了它们的相互作用。TBC1D23 的 C 末端 PH 结构域主要负责与 TBK1 接触，Rhodanese 结构域进一步促进这种相互作用。TBC1D23 的 K632E/K633E/K634E 三突变体（3K）与 TBK1 的相互作用消失，在 TBC1D23 缺失的 MEFs 中重新表达 TBC1D23 WT 可挽救 TBK1 和 STING 的磷酸化，而 3K 突变体则不能。此外，敲除 Tbc1d23 不影响 STING 从内质网到高尔基体的转运，但显著降低了 DMXAA 处理后 STING 的磷酸化水平。

研究结论和讨论部分指出，TGN 拴系因子主要调节 STING-IFN-I 信号通路，氧化应激导致 TGN 拴系因子的错位和降解，从而抑制 STING-IFN-I 信号通路。这一研究揭示了衰老细胞中特异性调节 STING-IFN-I 信号的机制，有助于解释为什么老年人炎症反应活跃但免疫功能却受损。同时，研究还发现 golgin-97 在调节 cGAS-STING 通路中的作用与其他拴系因子不同，其具体机制有待进一步研究。此外，研究人员认为 Arl1 是调节 IFN-I 信号的关键治疗靶点，抑制 Arl1 降解的小分子可能恢复 TGN 拴系因子的水平，增强 STING-IFN-I 信号，有望用于提升老年人的抗病毒和抗肿瘤功能。这项研究为深入理解免疫反应的调控机制提供了新的视角，为相关疾病的治疗和干预提供了潜在的靶点和理论依据。