Gasdermin D N 端结构域泛素化在细胞焦亡中的关键作用：开辟炎症性疾病治疗新方向

为探究 Gasdermin D（GSDMD）激活机制，研究人员发现 GD-NT泛素化调控其膜定位和激活，或为相关疾病治疗提供新靶点。

　　在细胞的世界里，有一种特殊的死亡方式 —— 细胞焦亡（pyroptosis），它就像细胞内部的一场 “火山爆发”。细胞焦亡时，细胞膜会形成小孔，细胞内容物释放出来，引发炎症反应。这一过程在抵抗病原体入侵、对抗癌症等方面发挥着重要作用，但如果它失控了，也会参与多种疾病的发展，比如脓毒症、自身免疫性疾病等。Gasdermin D（GSDMD）作为细胞焦亡的关键介导者，一直是科研人员关注的焦点。它由 N 端成孔结构域（GD-N_T）和 C 端自抑制结构域组成。当细胞受到刺激，炎性半胱天冬酶（caspase-1/11 等）会切割 GSDMD，释放出 GD-N_T，GD-N_T就像被激活的 “小战士”，会发生寡聚化、膜转位并形成小孔，最终导致细胞焦亡。然而，GD-N_T和全长 GSDMD（GD-F_L）为何会有如此不同的生物学活性，背后的机制却并不清楚。

为了揭开这个谜团，郑州大学第五附属医院的研究人员展开了深入研究。他们的研究成果发表在《Cell Death and Disease》杂志上，为我们理解细胞焦亡的调控机制提供了新的视角，也为相关疾病的治疗带来了新的希望。

研究人员为了开展此项研究，运用了多种关键技术方法。在蛋白质检测方面，通过免疫印迹（immunoblot）和免疫沉淀（immunoprecipitation）技术，分析不同蛋白的表达和相互作用情况；利用 GST pulldown 和 NI/NTA pulldown 技术，富集和检测特定的蛋白质；借助细胞分馏技术，研究蛋白在细胞内不同部位的分布。此外，还通过构建稳定细胞系、进行细胞毒性和细胞活力检测、动物实验（如小鼠异种移植实验和脓毒症模型实验）以及免疫荧光染色和荧光显微镜观察等方法，从多个层面探究 GSDMD 的功能机制。

研究结果显示：

1. GD-N_T的 K63 连接多聚泛素化修饰：研究人员构建了表达 GD-F_L、GD-N_T等的载体，并转染到细胞中进行检测。结果发现，GD-N_T，而非 GD-F_L，在细胞中会发生大量的泛素化修饰，且主要是 K63 连接的多聚泛素化。这一结果通过多种实验方法，如免疫沉淀结合免疫印迹、Ni-NTA pulldown 等得以验证。
2. TRAF1-OTUB1 轴对 GD-N_T泛素化的调控：为了找出负责 GD-N_T K63 连接泛素化的 E3 连接酶和去泛素化酶（DUB），研究人员进行了一系列实验。他们将 Flag-GD-N_T与不同的 E3 连接酶共转染到 HEK293 细胞中，发现 TRAF1 与 GD-N_T相互作用，且 TRAF1 能显著增强 GD-N_T的 K63 连接泛素化，而 shTRAF1 则使其泛素化水平下调。同时，研究人员还发现 OTUB1 能特异性地降低 GD-N_T的 K63 连接泛素化，shRNA 介导的 OTUB1 沉默会增加其泛素化水平。这表明，TRAF1-OTUB1 轴对 GD-N_T的 K63 连接泛素化起着关键的调控作用。
3. GD-N_T的泛素化位点：通过在线数据库搜索和序列比对，研究人员确定了 GD-N_T上的几个潜在泛素化位点，包括 Lys204、Lys205 和 Lys237（人源为 Lys203、Lys204 和 Lys236）。他们构建了非泛素化突变体 GD-N_T-K237R 和 GD-N_T-K204/205R，并进行实验。结果显示，K237R 突变显著损害了 GD-N_T的 K63 连接多聚泛素化，而 K204/205R 突变则没有明显影响。这表明，GD-N_T的 K63 连接多聚泛素化主要发生在 Lys237 位点，且该过程受 TRAF1-OTUB1 轴调控。
4. K63 连接多聚泛素化对 GD-N_T焦亡活性的影响：研究人员通过转染不同的 GD-N_T突变体到细胞中，研究 K63 连接多聚泛素化对其功能的影响。结果发现，GD-N_T-K237R 突变体无法通透细胞膜并转移到培养基中，其在细胞膜和不溶性细胞骨架部分的含量减少，且不能形成寡聚体。这表明，当 GD-N_T在 Lys237 位点被 K63 连接多聚泛素化修饰时，会失去细胞焦亡活性。
5. GD-N_T-K237R 在体内外的作用：在体外实验中，转染 GD-N_T-K237R 的 HEK293 细胞没有表现出明显的细胞毒性，细胞死亡和活力检测也表明其无法介导细胞焦亡。在体内实验中，通过构建 HeLa 细胞的异种移植模型，研究人员发现表达 GD-N_T-K237R 的肿瘤生长速度与表达空载体的肿瘤相似，而表达 GD-N_T野生型的肿瘤生长速度较慢。这说明，K63 连接多聚泛素化修饰阻止了 GD-N_T在体内外介导细胞焦亡。
6. UBA1 抑制剂 PYR-41 的作用：由于 K63 连接泛素化在 GD-N_T细胞焦亡活性中起重要作用，研究人员评估了靶向泛素化的小分子对 GD-N_T介导的细胞焦亡的影响。他们发现，UBA1 抑制剂 PYR-41 能显著降低 GD-N_T的泛素化水平，抑制 293-tetO-GD-N_T细胞、永生化骨髓来源巨噬细胞（iBMDM）的细胞焦亡，减少脓毒症小鼠中 IL-18 和 TNFα 的释放。这表明，抑制 GD-N_T的泛素化可以抑制其介导的细胞焦亡，减轻小鼠脓毒症的严重程度。

研究结论和讨论部分指出，GD-F_L和 GD-N_T虽然源自相同的氨基酸序列，但功能却大不相同。GD-N_T具有独特的泛素化状态，其在 Lys237 位点的 K63 连接多聚泛素化是一种切割后的修饰事件，有助于 GD-N_T转位到细胞膜并形成小孔，从而促进细胞焦亡。此外，UBA1 抑制剂 PYR-41 能有效抑制 GD-N_T介导的细胞焦亡，这为细胞焦亡相关疾病的治疗提供了新的潜在靶点和治疗思路。该研究不仅阐明了泛素化在调节 GD-N_T诱导的细胞焦亡中的独特作用，还为通过小分子调节 GSDMD 的翻译后修饰（PTMs）来治疗相关疾病开辟了新的途径，有望在未来的临床治疗中发挥重要作用。