IL-9-ZBTB18 轴调控生发中心来源记忆 B 细胞发育的关键机制

本文揭示 IL-9-ZBTB18 轴调控生发中心（GC）来源记忆 B 细胞（MBC）发育及功能的机制。

　　

一、研究背景

抗原特异性记忆 B 细胞（MBC）在体液免疫及抗体疫苗设计中至关重要，生发中心（GC）是其重要来源。MBC 与 GC B 细胞在细胞周期、定位和存活等方面存在显著差异，从 GC 状态转变为 MBC 状态需要协调改变这些特性。目前对于协调这些变化的转录因子理解存在分歧，同时 MBC 发育是否受细胞因子等外源因素促进也有待明确。白细胞介素 9（IL-9）对正常回忆抗体反应具有重要意义，但它在 MBC 发育中的作用存在争议，因此探究 IL-9 在 MBC 发育和功能中的作用及下游转录调节因子具有重要意义。

二、研究结果

1. IL-9 对体液免疫回忆及 MBC 发育和功能的关键作用
   • 研究发现，缺乏 IL-9 受体的小鼠初次抗体反应正常，但二次反应受损。通过免疫 Il9^-/-和 Il9^+/+小鼠并进行二次挑战实验，发现 Il9^-/-小鼠二次挑战后 NP 特异性抗体滴度几乎无变化，而野生型小鼠显著增加，证实 IL-9 在促进体液免疫回忆中具有重要作用。
   • 采用过继转移实验，将 NP 结合的 MBC 从 Il9^-/-和 Il9^+/+小鼠转移到 OVA 预致敏的小鼠中，发现 Il9^-/-小鼠来源的 MBC 产生的浆细胞（PCs）和 GCs 数量显著减少，表明 IL-9 在促进 B 细胞记忆方面具有明确作用。
   • 构建不同的嵌合体小鼠，实验结果表明 T 细胞来源的 IL-9 而非 B 细胞来源的 IL-9 促进了 MBC 的发育和功能，明确了 IL-9 促进功能性 B 细胞记忆是通过 T 细胞教育模型，而非 B 细胞自分泌刺激模型。
2. T 细胞来源的 IL-9 在初级反应中对 MBC 发育的关键作用
   • 将 GFP 转基因 B1-8^hi B 细胞转移到野生型或 Il9^-/-受体小鼠中，免疫后再将这些小鼠的 B1-8^hi MBC 转移到 OVA 预致敏的受体小鼠中。结果显示，在 Il9^-/-宿主中发育的 B1-8^hi MBC 产生的 PCs 和 GCs 显著减少，进一步支持了 T 细胞来源的 IL-9 在初级反应中对 MBC 发育的关键作用。
   • 研究还发现，不同时间点收获的 MBC 在回忆反应中存在差异，这与 IRF4 控制的表观遗传机制有关，该机制记录和读取 MBC 的刺激历史，决定其分化命运。
   • 通过遗传脉冲追踪实验证实，IL-9 阻断会减少 GC 来源的 MBC 输出，且 IgG⁺ MBC 减少更为明显，这解释了 IL-9 缺乏时 MBC 回忆缺陷的原因，即 IL-9 促进了更具功能性和可回忆性的 GC 来源 MBC 的发育。
3. IL-9 诱导 ZBTB18 在 GC 记忆前体中的表达
   • 通过对 GCMP 细胞转录组数据的分析，发现 ZBTB18 是一个受 IL-9 调控的转录因子。ZBTB18 在 naive B 细胞中低表达，在 GC 细胞中表达进一步抑制，而在 GCMP 细胞和抗原特异性 MBC 中表达增加。
   • 通过构建 Zbtb18^FLAG-in敲入报告菌株，从蛋白质水平证实了 ZBTB18 在 GCMP 细胞和 MBC 中的表达增加。同时发现，IL-9 刺激可使 GC LZ 细胞中 Zbtb18 mRNA 表达迅速增加，而 GCMP 细胞来自 Il9^-/-小鼠的则表达较低水平的 Zbtb18 mRNA。
   • 研究表明，IL-9 通过 STAT1 信号通路调控 ZBTB18 的表达，STAT1 与 ZBTB18 基因启动子区域结合，且 STAT1 过表达可导致 ZBTB18 表达增加，IL-9 处理后 STAT1 和 ZBTB18 在 GCMP 细胞中的核定位更明显。此外，强制 NP 特异性 B1-8^hi细胞过表达 ZBTB18 可产生更多 MBC，表明 ZBTB18 是驱动 MBC 形成的重要因子。
4. ZBTB18 对 GC 来源 MBC 发育的重要作用
   • 创建条件性 ZBTB18 敲除等位基因，使用 Mb1-cre 在 B 细胞谱系中限制基因敲除。实验结果显示，ZBTB18 敲除小鼠的骨髓 B 细胞发育、naive B 细胞激活和 GC 形成均未受影响，但 GC 来源的 MBC 发育受到显著抑制，表现为 tdTomato⁺ MBC 丰度明显降低，GCMP 细胞在 GC 中的比例增加。
   • 在免疫后的不同时间点检查 ZBTB18 敲除小鼠，均观察到 GCMP 细胞在 GC 中的比例增加和 MBC 数量减少，表明 ZBTB18 对 GC 来源 MBC 的最佳发育具有促进作用。
5. ZBTB18 对细胞周期退出的调控作用
   • 对 ZBTB18^BKO和 ZBTB18^BWT CD38⁺IgD^?Fas⁺GL7⁺ GCMP 细胞进行 mRNA 测序分析，发现 ZBTB18 缺失时，促进细胞周期进展的基因表达增加，这些基因的启动子区域含有 ZBTB18 结合基序。
   • 通过 ATAC-seq 实验发现，ZBTB18 靶向基因的染色质可及性在 ZBTB18 缺失时增加。对 5 个细胞周期相关基因的深入分析表明，ZBTB18 可直接抑制这些基因的表达，通过荧光素酶实验和 ChIP-qPCR 实验证实了 ZBTB18 对这些基因启动子的结合和抑制作用。
   • 通过 EdU 掺入实验和 DNA 含量分析发现，ZBTB18^BKO GCMP 细胞处于 S 期和 S/G2/M 期的比例增加，G1/G0 期比例减少，表明 ZBTB18 通过直接抑制细胞周期促进基因，促进细胞周期退出，进而促进 GC 到 MBC 的转变。
6. ZBTB18 对细胞存活的促进作用
   • RNA-seq 分析发现，ZBTB18^BKO GCMP 细胞中凋亡促进基因 Casp3 和 Bid 表达升高，这两个基因的启动子区域含有 ZBTB18 结合基序，且其启动子活性受到 ZBTB18 的抑制。
   • ChIP-qPCR 实验证实了 ZBTB18 与 Casp3 和 Bid 启动子的结合。活性 caspases 检测实验表明，ZBTB18^BKO GCMP 细胞中活性 caspases 的比例显著增加，且这种增加仅在 Ki67^?细胞中观察到，表明 ZBTB18 通过抑制 Casp3 和 Bid 的表达，促进 MBC 前体的存活。
7. ZBTB18 对 GC 离开的促进作用
   • 在 ZBTB18 缺失的情况下，GCMP 细胞在 GC 中的比例增加，MBC 在脾脏中的丰度降低，且 GCMP 细胞离 GC 边缘的距离更远，表明其离开 GC 的过程受阻。
   • S1PR2 是一种对 GC 细胞密集聚集至关重要的受体，其表达下调是细胞离开 GC 的必要条件。研究发现，ZBTB18^BKO GCMP 细胞中 S1pr2 表达水平高于 ZBTB18^BWT细胞，通过 Transwell 实验证实 ZBTB18^BKO细胞表达更高水平的功能性 S1PR2 受体蛋白。
   • 进一步研究表明，ZBTB18 直接抑制 S1pr2 的表达，通过荧光素酶实验和 ChIP-qPCR 实验证实了 ZBTB18 与 S1pr2 启动子的结合和对其表达的抑制作用，表明 ZBTB18 通过抑制 S1pr2 促进 GCMP 细胞离开 GC。
8. IL-9-ZBTB18 轴对 MBC 发育和功能的调控作用
   • GCMP 细胞在缺乏 IL-9 时，ZBTB18 靶向基因表达异常升高，而 IL-9 处理可导致这些基因表达下调，且这种效应在 ZBTB18 缺失时显著减弱。
   • 强制 ZBTB18 在抗原特异性 B 细胞中表达可在很大程度上挽救 Il9^-/-小鼠中受损的 MBC 形成。IL-9 处理和抗 IL-9 阻断对正常 B 细胞中 GC 来源的 NP 结合 MBC 发育有显著影响，但对 ZBTB18 缺陷的 B 细胞无明显作用，进一步支持 ZBTB18 是 IL-9 介导的记忆促进功能的下游效应器。
   • 对 ZBTB18^BWT和 ZBTB18^BKO MBC 进行回忆实验，发现 ZBTB18^BKO MBC 产生的 PCs 和 GCs 数量显著少于野生型，抗体滴度也明显降低，表明 IL-9-ZBTB18 轴对 MBC 的发育和回忆功能具有重要调控作用。

三、研究讨论

1. IL-9 在 MBC 发育中的作用通过嵌合体和过继转移实验明确了 T 细胞来源的 IL-9 在初级反应中促进 MBC 从 GC 发育的关键作用，虽然不排除非 B 细胞来源的 IL-9 在二次反应中增强回忆的可能性，但本研究强调了 T 细胞来源 IL-9 的重要性。
2. ZBTB18 的关键作用及机制ZBTB18 是 GC 来源 MBC 发育的关键转录因子，它受 IL-9 诱导，通过直接抑制一系列促进细胞周期、增强凋亡和维持 GC 保留的基因，促进 GCMP 细胞停止循环、提高存活能力并离开 GC 成为 MBC。此外，ZBTB18 还可能通过抑制 PI3K 和 mTORC1 活性，抑制 DZ 重新进入，进一步促进 MBC 发育。
3. 与其他转录因子的关系转录因子 HHEX 也促进 MBC 发育，它与 ZBTB18 可能顺序发挥作用。HHEX 抑制 BCL6 介导的 GC 程序，增强 GCMP 细胞的生存能力，而 ZBTB18 促进细胞周期停滞、进一步提高生存能力并促进 GC 离开。IL-9 可能通过上调 HHEX 和 ZBTB18，共同调控 MBC 的发育和功能，这也解释了为什么 IL-9 缺乏导致的记忆缺陷比 ZBTB18 缺乏更严重。
4. IL-9-ZBTB18 通路的独特性及其他细胞来源的 IL-9IL-9 是目前发现的唯一能在 B 细胞中上调 ZBTB18 的细胞因子，但该通路的具体连接方式尚待研究。除 T 细胞外，其他细胞如 2 型先天淋巴细胞也可产生 IL-9，它们可能通过提供额外的 IL-9 来调节 B 细胞记忆的发育和功能。
5. IL-9-ZBTB18 轴在初级反应中的作用及 MBC 回忆偏好在初级反应的各个阶段，IL-9-ZBTB18 轴均发挥作用，其缺失会导致 GCMP 细胞在 GC 中的比例增加，GC 来源的 MBC 丰度降低。此外，抗原回忆的 MBC 产生的二次 GCs 和 PCs 的相对数量可能因 MBC 来自初级反应的早期或晚期而有所不同，这反映了 PC 与 GC 偏好由 B 细胞成为 MBC 之前所接受的刺激的累积历史决定的表观遗传机制。

四、研究局限性

本研究依赖于所有 B 细胞或所有 GC B 细胞缺乏 ZBTB18 的实验系统，无法排除基因敲除的 B 细胞对其他非 B 细胞元件的潜在间接影响。此外，当前研究基于蛋白质免疫模型，IL-9-ZBTB18 轴在微生物感染或其他复杂抗原免疫后的 MBC 发育中的作用仍有待测试。

五、研究展望

未来的研究可以进一步探究 IL-9-ZBTB18 通路的详细机制，以及其他细胞来源的 IL-9 在 B 细胞记忆发育中的具体作用。同时，拓展研究不同抗原免疫和微生物感染情况下 IL-9-ZBTB18 轴的功能，将有助于更全面地理解其在免疫应答中的作用，为疫苗设计和免疫治疗提供更深入的理论基础。