细胞有丝分裂中凝聚素 I 核定位调控机制及其对染色体分离的影响

本文揭示凝聚素 I（condensin I）和 II（condensin II）时空协调机制，对理解染色体分离意义重大。

　　

研究背景

在细胞有丝分裂过程中，染色体的正确分离对于维持细胞遗传信息的稳定至关重要。这一过程伴随着染色体从间期的松散状态转变为有丝分裂期特有的杆状结构，其中涉及两个关键的结构变化：姐妹染色单体的分离（姐妹染色单体分辨率，sister chromatid resolution）和每条染色单体的折叠（染色体折叠，chromosome folding） 。这两个变化对于后续有丝分裂后期染色体的正确分离是必不可少的。在时间顺序上，姐妹染色单体分辨率在人类细胞中比染色体折叠早 15 - 20 分钟发生，但目前尚不清楚这两个过程是如何在时间上协调的，以及这种协调对染色体的正确分离是否重要。

有丝分裂染色体的重组依赖于凝聚素复合物（condensin complexes），大多数多细胞生物含有两种不同类型的凝聚素复合物：凝聚素 I 和凝聚素 II。它们都包含相同的 SMC2 和 SMC4 成分，但 kleisin 和 Hawk 蛋白不同。尽管结构相似，但缺失凝聚素 I 或 II 会产生不同的表型，表明它们在有丝分裂中执行不同的任务。凝聚素 II 在解开复制的姐妹染色单体中起重要作用，而凝聚素 I 则在有丝分裂后期组织折叠的染色体。此外，近期研究表明，凝聚素 II 形成相对较大的染色质环，凝聚素 I 在其内部形成较短的嵌套环，这种环大小的差异导致了它们在有丝分裂染色体重组中的不同作用。

有一种假设认为，凝聚素 I 和 II 的亚细胞定位差异在协调姐妹染色单体分辨率和染色体折叠的时间上起重要作用。凝聚素 II 在整个细胞周期中都定位于细胞核，而凝聚素 I 在间期和前期位于细胞质中，只有在核膜（NE）破裂后才能进入细胞核接触染色体。在本研究中，科研人员通过活细胞实验来验证这一假设，并探究这两个事件的时间协调对后续有丝分裂后期染色体正确分离的重要性。

实验设计

为了研究凝聚素 I 在间期和前期被排除在细胞核外的功能重要性，科研人员构建了稳定的 HT - 1080 二倍体细胞系，使其表达在 C 末端含有三个核定位信号（NLS）的凝聚素 I 特异性亚基 NCAPD2（NCAPD2 - Cer - NLS），同时构建了不含有 NLS 的对照细胞系（NCAPD2 - Cer）。这些构建体带有沉默突变，使其在使用小干扰 RNA（siRNA）耗尽内源性 NCAPD2 时具有抗性。

科研人员此前开发了一种新颖的实时检测方法，用于分析活细胞中的姐妹染色单体分辨率和染色体折叠。在该方法中，将lac - 和tet - 操纵子阵列整合到人类 5 号染色体上相距 245 kb 的两个位点，通过观察与这些阵列结合的 GFP 和 mCherry 荧光点的配置变化，来分析有丝分裂早期姐妹染色单体分辨率和染色体折叠的进程。利用这一方法，科研人员评估了凝聚素 I 核定位对这两个过程时间的影响。

同时，科研人员还研究了凝聚素 I 核定位对有丝分裂进程的影响。使用已构建的细胞系，通过 siRNA 处理耗尽内源性 NCAPD2 并同步化细胞，添加 SiRDNA 对染色体进行荧光标记，然后通过显微镜观察细胞，测量关键有丝分裂事件的时间。此外，科研人员探究了凝聚素 I 核定位对染色体分离的影响，观察并分类细胞在有丝分裂后期的染色体分离情况，分析染色体错分离的原因。

实验结果

通过实验，科研人员发现当内源性 NCAPD2 被 siRNA 耗尽时，NCAPD2 - Cer 和 NCAPD2 - Cer - NLS 的表达水平增强。在间期和前期，NCAPD2 - Cer - NLS 主要定位于细胞核，而 NCAPD2 - Cer 主要定位于细胞质。并且，当 NCAPD2 - Cer - NLS 表达时，其他凝聚素 I 亚基也显示出更高水平的核定位，表明整个凝聚素 I 复合物的定位发生了改变。在有丝分裂前期 / 中期，两种细胞系中定位在浓缩染色体上的 NCAPD2 - Cer 和 NCAPD2 - Cer - NLS 的量相似，说明 NLS 的存在不影响凝聚素 I 与染色体的结合。

在分析姐妹染色单体分辨率和染色体折叠时，科研人员发现表达 NCAPD2 - Cer 的细胞，其染色体折叠主要在核膜破裂（NEBD）后增加，与野生型细胞相似；而表达 NCAPD2 - Cer - NLS 的细胞在前期就出现了折叠构型的增加，这表明凝聚素 I 的核定位使染色体折叠时间从前期提前到了中期。但在间期，尽管 NCAPD2 - Cer - NLS 定位于细胞核，但它既不促进染色体折叠，也不与染色体结合，这可能是因为凝聚素 I 需要被有丝分裂激酶如 cyclin B - Cdk1 激活才能发挥作用。

在研究凝聚素 I 核定位对有丝分裂进程的影响时，科研人员发现从 NEBD 到染色体排列在两种细胞系中相似，但 NCAPD2 - Cer - NLS 细胞中有 39% 出现了从中期到后期的延迟，而 NCAPD2 - Cer 细胞中只有 15% 出现延迟，这表明凝聚素 I 的核定位导致部分细胞后期起始延迟。进一步研究发现，这种延迟依赖于纺锤体组装检查点（SAC），当使用 SAC 调节剂 Mps1 激酶的抑制剂 CPD - 5 时，几乎所有细胞都能正常进入后期。

对于染色体分离的研究，科研人员发现 NCAPD2 - Cer - NLS 细胞中 38% 出现染色体分离缺陷，而 NCAPD2 - Cer 细胞中只有 16%。这些缺陷包括滞后染色体和核分离缺陷等，且 NCAPD2 - Cer - NLS 细胞中滞后染色体常涉及姐妹染色单体对。通过对滞后染色体的进一步分析，科研人员发现 NCAPD2 - Cer - NLS 细胞中姐妹染色单体分辨率往往不完全，表现为姐妹染色单体之间的距离较短，PICH 信号增加等。

研究结论

综合以上结果，科研人员得出结论：在生理情况下，前期凝聚素 I 被排除在细胞核外，延迟了染色体折叠，使凝聚素 II 能够完成姐妹染色单体分辨率，从而确保有丝分裂后期染色体的正确分离。如果凝聚素 I 在前期进入细胞核，会导致染色体折叠提前，与姐妹染色单体分辨率同时发生，进而影响姐妹染色单体分辨率的完成，导致染色体错分离增加。

这一研究揭示了凝聚素 I 和凝聚素 II 在时间上的协调机制，对理解染色体分离的分子机制具有重要意义。同时，研究结果还表明，凝聚素 I 和 II 的亚细胞定位差异在确保染色体正确分离中起关键作用。然而，目前仍不清楚在哺乳动物细胞中它们的亚细胞定位是如何在细胞周期中调控的。此外，凝聚素 I 和 II 亚基的各种突变与癌症或其他疾病相关，这些突变可能影响凝聚素复合物的内在活性或亚细胞定位，进一步研究这些突变如何损害凝聚素复合物的功能以及导致人类疾病的机制，将为相关疾病的治疗提供新的思路。