FOXL2：卵巢早期发育中支持性腺细胞分化的关键 “推手”

为探究 FOXL2 在早期人类卵巢体细胞发育中的作用，研究人员经实验发现其推动细胞分化，助力理解性腺发育。

　　在生命的奇妙旅程中，人类的性别决定从一开始就充满了奥秘。曾经，人们以为卵巢发育是一个自然而然的 “默认过程”，可随着研究的深入，大家才惊觉它是一场受特定基因精密调控的 “华丽演出”。FOXL2 基因，作为其中的关键角色，编码着一种叉头转录因子，主要在卵巢、垂体和眼睑中表达。它就像一个 “幕后大导演”，在哺乳动物的性别决定、卵巢发育、维持和功能中都发挥着至关重要的作用。一旦它出现 “故障”，也就是发生突变，在人类中就会引发眼睑下垂、内眦赘皮综合征（BPES），还可能间接导致性别发育差异（DSD），甚至与原发性卵巢功能不全相关。

尽管科学家们利用小鼠、山羊等动物模型对 FOXL2 在卵巢发育中的作用进行了大量研究，但它在人类卵巢早期发育过程中的具体功能，依旧像蒙着一层神秘的面纱，让大家难以看清。为了揭开这层面纱，来自芬兰赫尔辛基大学和赫尔辛基大学医院妇产科、瑞典卡罗林斯卡学院等机构的研究人员展开了深入研究，相关成果发表在《Reproductive Biology and Endocrinology》杂志上。

在这项研究中，研究人员运用了 CRISPR/Cas9 基因组激活技术（一种能够对基因进行精准编辑的强大工具），结合此前已发表的 14 天性腺分化方案，对 FOXL2 的功能展开探索。

研究结果表明：

• FOXL2 抑制性腺标记物表达：研究人员构建了双诱导 FOXL2 激活细胞系 H9-FOXL2-DDdCas9VP192，并使其经历性腺分化过程。通过实时定量聚合酶链反应（RT-qPCR）分析发现，在分化第 4 天诱导 FOXL2 表达后，其表达水平平均上调约 200 倍，同时导致性腺标记物 LIM 同源盒 9（LHX9）显著下调，一些早期性腺标记物，如体腔上皮标记物 GATA 结合蛋白 4（GATA4）、雌性性腺标记物 R-spondin 1（RSPO1）和 Wnt 家族成员 4（WNT4）、雄性性腺标记物 SRY-box 转录因子 9（SOX9）、沙漠刺猬因子（DHH）和核受体亚家族 0 组 B 成员 1（NR0B1），以及性腺标记物抑制素 βa 亚基（INHBA）的基因表达水平也有所降低。免疫荧光染色进一步证实，在分化第 14 天，诱导状态下 FOXL2 蛋白明显可检测，而 GATA4 和 DHH 的表达在蛋白水平下降。相比之下，在第 8 天诱导 FOXL2，虽然其基因表达水平平均上调约 300 倍，但对体腔上皮标记物和雌性性腺标记物的影响较小。这说明在分化过程中，越早诱导 FOXL2，对性腺标记物表达水平的影响越显著，且在性腺发育早期，FOXL2 主要发挥抑制作用。
• FOXL2 诱导转录变化：研究人员对未诱导和诱导的细胞进行批量 RNA 测序（RNA-seq）分析。主成分分析（PCA）显示，样本间的差异部分归因于性腺分化过程，部分归因于 FOXL2 诱导。在分化第 6 天，对诱导和未诱导细胞进行成对差异表达比较，绘制热图展示上调最明显的 100 个差异表达基因（DEGs），发现 LINC01391、FOXL2 邻居（FOXL2NB）和 FOXL2 是上调最显著的基因。京都基因与基因组百科全书（KEGG）和基因本体（GO）通路分析表明，第 6 天上调的 DEGs 与细胞黏附分子、吞噬体、神经活性配体 - 受体相互作用等 KEGG 通路以及激素调节、上皮连接形成等 GO 通路相关。在不同时间点，上调的 DEGs 主要与涉及细胞黏附分子的 KEGG 通路和与细胞外基质及连接形成相关的 GO 通路有关，这反映了细胞在分化过程中身份的变化。
• FOXL2 促进细胞命运转变：研究人员将自己的数据与此前两项关于体内早期性腺发育的研究数据进行对比。通过成对 DE 比较分析发现，仅考虑性腺分化时，体腔上皮标记基因 GATA4 和 uroplakin 3b（UPK3B）在第 6 天上调，LHX9 在第 6 天后出现，ARX 和 GATA2 在第 10 天上调，之后这些标记基因持续上调；仅考虑 FOXL2 诱导时，第 6 天只有 FOXL2 差异表达且上调，第 8 天体腔上皮标记基因 GATA4、UPK3B 和 LHX9 下调，ARX、GATA2 和 FOXL2 上调，第 10 天体腔上皮基因持续下调，早期支持性腺细胞（ESGC）标记物如富含亮氨酸重复序列的 G 蛋白偶联受体 5（LGR5）、四跨膜蛋白 8（TSPAN8）、奇数跳相关转录因子 1（OSR1）和 TAC1 首次与 FOXL2 一起上调；综合考虑性腺分化和 FOXL2 诱导时，DEGs 与仅分化和仅诱导的比较有相似之处，但更接近仅性腺分化的情况，最明显的差异是 FOXL2 和 OSR1 上调，LGR5 在所有时间点持续下调。RT-qPCR 对关键标记基因的验证进一步支持了 RNA-seq 数据。这表明 FOXL2 诱导似乎引导细胞从体腔上皮身份向 ESGC 阶段转变，甚至可能向 pre-granulosa 细胞转变。

研究人员在讨论中指出，这项研究首次证明 FOXL2 不仅是 ESGCs 的标记物，还在其形成过程中发挥潜在作用。通过实验，成功在体外复制了体内早期（6 - 8 周）pre-granulosa 细胞形成的关键发育阶段，为研究由 FOXL2 突变引起的疾病，如 BPES 和 DSD 的病理机制提供了宝贵的工具。不过，研究也存在一些局限性，比如各发育阶段细胞的异质性，以及结果仅基于体外实验。未来，研究人员希望找到能替代 CRISPR/Cas9 技术内源性上调 FOXL2 的生长因子或小分子，这将有助于该分化方案在临床中的应用。

总的来说，这项研究揭示了 FOXL2 在女性人类多能干细胞（hPSC）系性腺分化过程中，从体腔上皮细胞向 ESGCs 转变的关键作用，并且证实了它在早期就能抑制男性性别分化相关基因的表达。这一成果为理解人类胎儿卵巢发育的机制提供了重要依据，在生殖医学和发育生物学领域具有重要的意义，有望为相关疾病的研究和治疗开辟新的方向。