鸡和野生鸟类中禽腺病毒 4 型的新型诊断方法与流行情况研究

为检测禽腺病毒 4 型（FAdV-4）核酸，研究人员整合 RAA 与 CRISPR/Cas12a 系统，发现野鸟或为病毒宿主，意义重大。

　　在禽类养殖的广阔天地里，禽腺病毒 4 型（FAdV-4）就像一个隐藏的 “杀手”，给养殖户们带来了巨大的困扰。FAdV-4 是水禽心包积液综合征（HPS）的病原体，自 1987 年在巴基斯坦首次被发现后，迅速在全球多地蔓延，包括伊拉克、日本、俄罗斯、韩国以及中国等国家 。感染 FAdV-4 的鸡会出现嗜睡、羽毛杂乱、食欲不振、绿色排泄物等症状，还会引发肝炎、心包积液和肾炎等典型病理变化，尤其是 3 - 5 周龄的肉鸡，感染后的死亡率可高达 80%。而且，FAdV-4 的 “魔爪” 还伸向了水禽和野生鸟类，这使得疫情防控变得更加复杂。

目前，虽然有一些检测 FAdV-4 的方法，如 TaqMan-based 实时荧光定量聚合酶链式反应（qPCR）、数字 PCR、环介导等温扩增（LAMP）实时浊度法和基于 CRISPR/Cas13a 的侧向流动分析法等，但这些方法或多或少都存在一些问题。血清学检测方法特异性和敏感性低，早期感染难以检测；一些室温扩增方法容易出现假阳性；传统 PCR 和 qPCR 则需要精密仪器，不适合在野外等条件简陋的地方使用。所以，开发一种简单、快速、可靠的诊断方法迫在眉睫。

为了解决这些难题，深圳金新农科技有限公司金新农农业产业研究院、南昌大学公共卫生学院、福建农林大学兽医学院、贵州省农业科学院、湖北省兽药监察所、湖北省农业科学院畜牧兽医研究所的研究人员共同开展了一项研究。他们将重组酶聚合酶扩增（RAA）与 CRISPR/Cas12a 系统相结合，成功建立了一种能够快速检测 FAdV-4 的新方法。该研究成果发表在《Animal Diseases》杂志上。

研究人员在开展研究时，主要运用了以下几种关键技术方法：首先是样本采集，他们从 2020 - 2024 年，在华中地区采集了肉鸡、蛋鸡、鸭、鹅、鸽子、大雁和乌鸦等鸟类的气管、泄殖腔拭子以及粪便样本 。接着，通过分析 FAdV-4 的 hexon 基因高度保守区域，设计出 RAA 引物和 CRISPR RNA（crRNA）。然后利用 RAA 技术在相对较低温度（37℃）下对 FAdV-4 目标双链 DNA 进行指数扩增，再让 Cas12a 蛋白在 crRNA 的辅助下识别并切割目标双链 DNA，激活 LbCas12a 核酸酶的反式切割活性，从而使标记的单链 DNA（ssDNA）报告分子被切割发出荧光信号，实现对 FAdV-4 的检测。

研究人员对 RAA/Cas12a 检测 FAdV-4 的方法进行了多方面优化。在 crRNA 和 RAA 引物的筛选中，设计了三对 crRNA 和三对 RAA 引物，以 pMD19 T-hexon 为模板进行反应。结果发现 crRNA-2 的荧光强度最高，RAA 引物二的荧光强度最高，所以后续实验选择了这两者 。在反应条件优化上，分别对不同温度（31℃、33℃、35℃、37℃、39℃、41℃）和不同时间（0、5、10、15、20 分钟）进行测试，确定了 Cas12a 介导切割反应的最佳条件为 37℃反应 15 分钟。

特异性和敏感性分析显示，该方法特异性极高。研究人员用它对 FAdV-1、FAdV-7 等多种常见禽病毒进行检测，只有含有 FAdV-4 的样本才会出现荧光或亮度变化。在敏感性方面，以 pMD19-T-hexon 的十倍系列稀释液为模板，在 LED 蓝光下目视观察，该方法的检测限低至 1 个拷贝。

在对鸟类临床样本的检测中，研究人员用 qPCR 和新建立的 RAA/Cas12a 方法对 30 份临床样本进行筛选，结果完全一致，证明了 RAA/Cas12a 方法检测临床样本中 FAdV-4 的准确性。

研究人员还对中国鸟类中 FAdV-4 进行了流行病学调查。他们检测了 640 份样本，总体阳性率为 30.78%。在家禽样本中，肉鸡的阳性率最高，为 27.97%；蛋鸡为 20.81%，鸭为 4.35%，鹅为 18.75%。在野生鸟类样本中，鸽子的阳性率最高，达到 67.86%，大雁为 47.46%，乌鸦为 4.0% 。这表明野生鸟类，尤其是鸽子和大雁，可能是 FAdV-4 的重要宿主，病毒在家禽和野生鸟类之间存在双向传播的可能。

综上所述，研究人员建立的 RAA-CRISPR/Cas12a 方法为 FAdV-4 的检测提供了一种便捷、灵敏的手段。该方法具有快速、简单、低成本的优势，适合在野外建立移动检测站，有助于及时发现疫情。同时，对鸟类中 FAdV-4 的流行病学调查，揭示了野生鸟类在病毒传播中的重要作用，为防控 FAdV-4 的传播提供了重要依据。后续还需要进一步加强对家禽和野生鸟类中 FAdV-4 的监测，深入研究病毒的传播机制，以便更好地制定防控策略，保障禽类养殖业的健康发展。