综述：小儿脓毒症患者血浆蛋白质组学 —— 希望与挑战

本文聚焦小儿脓毒症血浆蛋白质组学，阐述其在诊断、研究等方面的作用、前景与挑战。

　　# 小儿脓毒症患者血浆蛋白质组学 —— 希望与挑战

脓毒症现状与蛋白质组学研究意义

脓毒症是导致小儿发病和死亡的重要原因之一。全球每年 4890 万例脓毒症病例中，41.5% 涉及 5 岁以下儿童，死亡人数高达 290 万 。在中国，脓毒症相关死亡人数也相当可观，且地区差异明显。由于小儿免疫系统发育不完善等原因，脓毒症在小儿群体中的诊断和治疗面临诸多困难。

生物标志物在疾病检测和健康状态监测方面具有重要意义，但目前用于脓毒症诊断的生物标志物存在特异性和敏感性不足的问题。蛋白质组学作为新兴的 “组学” 领域，能够对蛋白质进行全面分析，血浆蛋白质组学研究有望发现新的脓毒症生物标志物，揭示疾病的病理生理机制，为脓毒症的诊断和治疗提供新的方向。

脓毒症的分子发病机制

固有免疫激活

微生物入侵时，细菌产生的病原体相关分子模式（PAMPs）和受损组织释放的损伤相关分子模式（DAMPs），会被宿主细胞表面的模式识别受体（PRRs）识别。这一识别过程刺激细胞内信号通路，引发免疫和宿主防御反应。免疫反应可分为三个阶段：立即的固有反应，在数秒到数小时内发生，主要由预先存在的非特异性或广泛特异性效应器识别入侵病原体或组织损伤；早期固有反应，在数小时到数天内，宿主识别 DAMPs 和 PAMPs，招募并激活效应细胞，进一步放大炎症反应；适应性反应，在数天到数周内发生，过度的适应性反应可能引发全身炎症反应，导致器官功能障碍 。

免疫抑制

过去针对脓毒症的治疗多集中于阻断早期炎症或宿主 - 病原体相互作用，但效果不佳。研究发现，脓毒症患者即使在细胞因子风暴消退后，仍易发生二次感染，且免疫抑制变化在死亡患者中更为明显。脓毒症诱导的固有免疫系统通过 Toll 样受体（TLRs）识别微生物并启动免疫反应，早期免疫细胞（如单核细胞 / 巨噬细胞、淋巴细胞和中性粒细胞）被激活，随后其活性下调，进入免疫抑制阶段，即免疫麻痹。同时，抗炎细胞因子（如 IL - 10）的分泌、免疫细胞（尤其是 T 和 B 淋巴细胞）的凋亡，以及髓源性抑制细胞（MDSCs）的积累，都对免疫抑制的发生起到重要作用 。然而，目前临床研究尚未明确这些变化与临床结局之间的联系，脓毒症相关免疫抑制的生物学机制仍有待深入探索。

小儿脓毒症与成人脓毒症的差异

免疫反应差异

小儿免疫系统发育不完善，在脓毒症发生时，更易出现免疫细胞失衡。与成人相似，小儿脓毒症患者也存在促炎和抗炎状态同时出现的情况，以及固有免疫和适应性免疫反应失调 。但小儿的免疫调节和补偿能力有限，个体差异大，新生儿和幼儿对许多病原体感染更为敏感。例如，2 岁以下儿童对严重病毒感染的抵抗力较弱，可能与干扰素 -γ 产生减少和细胞毒性淋巴细胞反应受损有关，导致病毒不受控制地增殖。此外，小儿在病毒休克早期出现的适应性和固有免疫抑制与不良预后相关，而初始的促炎反应与固有免疫损伤有关 。

临床症状差异

小儿脓毒症的临床症状具有特殊性。新生儿和婴儿的症状往往不典型，可能仅表现为嗜睡、不愿进食或体温不稳定；而年长儿童和成人则多表现出典型的脓毒症症状，如高热、低血压等 。小儿脓毒症进展迅速，新生儿和婴儿尤其容易出现血压突然下降和呼吸衰竭。由于症状不典型，小儿脓毒症容易被误诊为其他疾病。而且，小儿在严重心动过速时，循环系统仍能维持心输出量，通常直到发展为严重心血管疾病时才会出现低血压，因此低血压是小儿休克的晚期且令人担忧的症状 。此外，小儿在危重症时更容易发生呼吸衰竭，这与他们肺泡发育不成熟、胸壁顺应性差有关，容易导致肺不张、毛细血管渗漏、左心室衰竭和气道水肿，因此在小儿脓毒症治疗中，血流动力学治疗和呼吸通气支持至关重要 。

生理特性差异

小儿脓毒性休克与成人在生理特性上也存在差异。新生儿在从胎儿循环过渡时，可能会影响脓毒性休克的检测和早期管理，增加的肺血管阻力和不足的肺血流会阻碍气体交换，导致低氧血症、酸中毒和肺动脉高压，进而增加右心室后负荷，引发心力衰竭 。在血流动力学特征方面，多数婴儿脓毒性休克（58%）表现为 “冷休克”，而成人多表现为 “暖休克” 。虽然小儿和成人脓毒性休克都存在心肌抑制，但潜在的病理生理机制不同，新生儿和婴儿增加心输出量的能力有限，主要依靠心率有限上升来维持 。

蛋白质组学的发展

蛋白质组学的概念

1994 年，Marc Wilkins 提出 “蛋白质组” 的概念，它最初被定义为 “基因组的蛋白质补充物” 。细胞的蛋白质组决定其功能，细胞间相互作用则控制生物体的生理过程。蛋白质组学是对基因表达中蛋白质水平的定量评估，旨在阐明生物过程，包括疾病机制、治疗活性，以及揭示基因表达的调控机制 。蛋白质组学研究涵盖蛋白质的数量、大小、翻译后修饰（PTMs）、表达水平、定位、周转、溶解性、稳定性、结构以及与其他蛋白质的相互作用等方面，为人体结构、信号传导和酶学等方面提供直接信息，对疾病风险评估、诊断、预后、疾病进展预测、治疗反应评估和药物开发至关重要 。

蛋白质组学技术的发展

1. 二维凝胶电泳（2D - GE）：2D - GE 是蛋白质组学研究早期的基础技术，它通过等电聚焦和 SDS - PAGE 分离蛋白质，能够基于蛋白质的等电点和分子量进行高分辨率分离 。自 20 世纪 70 年代中期问世以来，它一直被用作蛋白质分析的定量工具。尽管质谱技术已成为蛋白质组学的主流，但 2D - GE 在特定医学研究场景中仍具有独特价值，它是唯一能够反复评估和定量完整蛋白质的蛋白质组学技术，可区分不同的蛋白质异构体，通过蛋白质斑点在 2D 凝胶上的分布变化，还能检测蛋白质的降解、化学改变或溶解性问题 。
2. 质谱（MS）：随着对蛋白质分析技术需求的增加，MS 凭借其高灵敏度和高分辨率，在蛋白质组学研究中越来越重要。自下而上的鸟枪法蛋白质组学是一种无凝胶的液相色谱 - 质谱（LC - MS）方法，能够检测样品中的所有蛋白质，与基于凝胶的蛋白质组学不同，它可以检测到样品中存在的所有蛋白质 。目前，大多数蛋白质组分析都采用标记和无标记的鸟枪法蛋白质组学技术 。
3. Olink 技术：尽管基于 MS 的蛋白质组学仍是蛋白质研究的主要方法，但一种新兴的基于抗体的蛋白质组学技术 ——Olink 技术正逐渐受到关注。该技术利用邻近延伸分析（PEA），将抗体检测的特异性与聚合酶链反应（PCR）技术的敏感性相结合，通过 DNA 聚合酶延伸寡核苷酸来增强敏感性。通过将靶位点与配对的抗体 - 寡核苷酸结合物偶联，并在抗原存在的情况下通过 qPCR 对已知寡核苷酸进行定量，实现高度特异性的蛋白质检测，最终结果以归一化蛋白质表达（NPX）值表示 。
4. Somalogic 技术：Somalogic 是一种基于亲和力的技术，可用于大规模检测各种蛋白质。适配体是经过工程改造的短寡核苷酸，能够特异性结合单个蛋白质。通过将含有随机序列的寡聚物引入靶蛋白，然后通过亲和选择分离靶 - 寡聚物对，并扩增剩余序列，经过系统进化配体富集技术（SELEX）的迭代过程，提高存活寡聚物对靶蛋白的特异性和亲和力，最终获得高亲和力的单个寡聚物 ——“适配体” 。修饰后的适配体（SOMAmers）可与荧光结合进行多重检测，能够同时测量数百到数千种蛋白质 。不过，SOMAScan 需要使用其他方法（如 ELISA）进一步定量，且 SOMAmers 仅对特定蛋白质具有特异性，目前其高昂的成本也限制了广泛应用 。

血浆蛋白质组学在脓毒症中的应用

细菌 / 真菌混合感染样本中菌株的鉴定

利用肽生物标志物结合自下而上的蛋白质组学（鸟枪法蛋白质分型），能够从阳性培养物中鉴定出与脓毒症相关的主要细菌属（如大肠杆菌、金黄色葡萄球菌和念珠菌），具有较高的敏感性和准确性 。但直接检测患者样本时，需要有效去除人类血细胞和血浆蛋白，因为这些成分会干扰细菌和真菌病原体的检测，而且蛋白质分型依赖于在任何分类学层次上识别独特的肽，这就需要精确且详尽的数据库，并且常常需要人工整理，否则可能导致肽的误识别，产生严重后果 。通过对常见脓毒症致病菌的蛋白质组学研究发现，不同致病菌暴露于人类血清后会产生脓毒症的分子特征，包括胆固醇获取、脂肪酸和脂质生物合成及代谢增加，以及嘌呤合成相关蛋白质丰度普遍降低等，这些发现为确定治疗干预的常见细菌靶点和转化医学研究提供了参考数据 。

脓毒症病理生理分子机制的发现

蛋白质组学作为后基因组时代生物技术研究的一个分支，为大规模蛋白质表征提供了途径。随着蛋白质组学技术的快速发展，监测脓毒症期间蛋白质组的变化并识别差异表达的蛋白质，有助于理解脓毒症的病理生理过程 。例如，单核细胞向有氧糖酵解的转变可能是临床脓毒症的一个独特特征，巨噬细胞和中性粒细胞吞噬功能受损以及单核细胞上人类白细胞抗原 - D 相关（HLA - DR）表达降低，是导致脓毒症免疫抑制的关键因素 。研究人员通过高通量串联 MS 描绘了脓毒症宿主反应的血浆蛋白质组景观，发现了与病因、临床表型（包括器官衰竭）和疾病严重程度相关的标志物，以及特定蛋白质、共表达模块和网络的显著变化，这些变化涉及固有免疫、急性期反应、中性粒细胞功能、细胞因子产生、脂质代谢、组织损伤保护和细胞外基质（ECM）组织等方面 。此外，一项前瞻性、多中心观察性队列研究发现，脓毒症早期血浆蛋白质组的变化与死亡率和疾病严重程度密切相关，其中固有免疫系统（尤其是补体激活）在脓毒症严重程度和死亡中起重要作用，为未来研究针对脓毒症潜在的固有免疫和凝血异常的靶向治疗奠定了基础 。

脓毒症潜在生物标志物的筛选与鉴定

由于宿主反应的复杂性，单一生物标志物无法完全表征或区分脓毒症的复杂性。过去 20 年，许多循环蛋白被研究作为脓毒症潜在的替代生物标志物，但只有降钙素原（PCT）在儿童临床试验中应用于床边诊断 。高灵敏度和高分辨率 MS 技术的出现，使人们能够在组织和生物流体中识别和定量蛋白质和肽，为疾病相关过程的分子机制提供了新的见解 。例如，APOA2 蛋白被确定为 H₂的靶标生物标志物，与脓毒症具有保护性因果关系，可作为 H₂治疗脓毒症相关肺损伤的靶点 。血浆蛋白质组学研究还表明，血浆脂蛋白在脓毒症患者中起着关键作用，补体激活导致脓毒症相关脑病，甘油三酯 / 胆固醇稳态与脓毒症相关急性肾损伤有关 。此外，研究发现脓毒症患者血浆中一些蛋白质的变化与器官功能障碍和死亡率相关，细菌脓毒症和 COVID - 19 血浆蛋白具有共同的蛋白质组特征和微血管损伤特征，这表明微血管损伤是常见的宿主生物学反应，血浆蛋白质组学为脓毒症的病理生理学研究提供了新的视角，有助于发现新的治疗靶点和筛选有效的分子预后标志物 。

脓毒症与其他疾病的鉴别诊断

噬血细胞性淋巴组织细胞增生症（HLH）、严重脓毒症和持续性全身炎症反应综合征（SIRS）都表现为免疫激活过度，这些疾病进展迅速，治疗不及时会导致高死亡率 。对于儿童严重脓毒症患者，及时启动抗菌治疗至关重要，而 HLH 患者则需要紧急免疫抑制治疗 。因此，鉴别脓毒症和 HLH 对患儿的治疗和预后至关重要。研究发现，血浆蛋白质组学可以通过 INF -γ 调节的 CXCL9 和 IL - 6 来区分 HLH 与脓毒症 / SIRS 患者 。通过基于适配体的多重蛋白质组学方法，能够识别血清蛋白质的变化，从而区分脓毒症与非感染性全身炎症 。利用机器学习的血浆蛋白质组学，还可以识别 TRIM21、PTN 和 CASP8 等生物标志物，比传统临床标志物更准确地区分 COVID - 19 和社区获得性肺炎脓毒症 。

血浆蛋白质组学在儿科疾病中的应用

蛋白质组学通过对疾病中蛋白质及其形式的非靶向分析，能够识别新的候选生物标志物。在羊水蛋白质组学分析中，中性粒细胞防御素 - 2、中性粒细胞防御素 - 1、S100A12 和 S100A8 被确定为宫内感染的四个生物标志物，可预测早发型新生儿脓毒症 。近二十年来，随着蛋白质组学技术的不断进步，血浆蛋白质组学在儿科疾病研究中越来越普遍，涵盖炎症性疾病、感染性疾病、呼吸系统疾病、血液系统恶性肿瘤、心血管疾病等多种疾病 。例如，研究人员通过 MS - 基于的 2DE 凝胶蛋白质组学和 ELISA 验证，发现针对 HSC70 的特异性抗体可能是幼年皮肌炎（JDM）的有价值诊断生物标志物 。在 1 型糖尿病儿童患者中，观察到胰岛自身免疫相关氧化应激蛋白的调节异常，关键抗氧化应激酶 CAT 和 SOD1 的时间表达模式表明它们可能作为 1 型糖尿病（T1D）的生物标志物 。在接受羟基脲积极治疗的 β - 地中海贫血患者中，鉴定出 28 个与红细胞生成应激和溶血相关的生物标志物 。对于癌症，蛋白质组学能够识别与霍奇金淋巴瘤治疗良好反应相关的生物标志物，以及检测高危或低危淋巴细胞白血病患者的生化特征 。此外，研究人员通过无标记定量蛋白质组学筛选和 ELISA 验证，确定 APOC1 为快速、无创诊断儿童肺炎支原体（MPP）的潜在生物标志物 。在儿科脓毒症研究中，靶向蛋白质组学分析表明，多种生物标志物（如 CRP、CETP 和 APOA - IV）的组合可更好地诊断晚发型新生儿脓毒症，而参与脂质代谢的三种蛋白质（APOA - IV、APOC - I 和 LCAT）可有效区分晚发型脓毒症和坏死性小肠结肠炎 。

小儿脓毒症血浆蛋白质组学的前景与挑战

前景

人体血液中含有组织特异性蛋白质，细胞损伤或死亡后这些蛋白质可能释放到血液中，其丰富程度、主要异构体、可变剪接变体、翻译后修饰和序列变体，能够反映循环系统和与血液接触的所有器官的当前功能状态 。对于儿童来说，血液是一种易于获取、广泛且敏感的诊断材料，适合进行非侵入性或微创性采样 。多项血浆蛋白质组学研究旨在识别小儿患者的早期蛋白质生物标志物和治疗反应指标，人体血清 / 血浆是蛋白质组学研究的核心临床样本，蕴含大量潜在的疾病生物标志物 。目前小儿脓毒症研究存在患者年龄分层、治疗反应异质性和缺乏特异性生物标志物等问题，而血浆蛋白质组学有望通过提供年龄特异性生物标志物，提高诊断效率和准确性，为儿童提供真正的个性化医疗 。

挑战

1. 技术和方法学挑战：蛋白质组学技术虽然取得了显著进展，但人体血液蛋白质丰度的广泛动态范围和蛋白质组的多样性，给研究带来了巨大挑战 。尽管免疫亲和耗尽和各种分级分离技术的进步，以及 LC - MS 系统的显著改进，有助于在更广泛的动态范围内研究血浆蛋白质组，但在蛋白质组分析平台常规用于临床应用之前，仍需解决动态范围、蛋白质组覆盖度、肽 / 蛋白质鉴定的可信度、定量准确性、分析通量和当前仪器的稳健性等关键问题 。此外，前瞻性生物标志物的研究和应用需要机构间的数据共享和标准，以确保数据的完整性和可比性，同时还需要开发实时监测生物标志物动态变化的工具 。
2. 生物标志物验证挑战：生物标志物容易受到年龄、性别、遗传背景和环境条件等因素的影响，难以建立一致且可重复的生物标志物阈值和特征 。而且，理想的生物标志物应具有高疾病特异性和敏感性，但许多生物标志物在不同群体中差异较大，难以满足治疗应用的标准 。因此，生物标志物的验证是一个耗时且昂贵的过程，需要在不同人群中进行验证，以确保其一致性和可靠性 。此外，临床样本中的验证必须与临床终点（如疾病诊断、疾病进展、预后和治疗反应）的评估相结合，但临床适用性的验证需要长期研究，这也是创新蛋白质组学研究大多仍处于临床前和观察性研究阶段的原因之一 。为了提高疾病预测的准确性，建议将生物标志物与临床症状相结合进行综合评估，同时确保足够的样本量和解决成本问题，探索多组学整合和改进生物信息学技术也具有重要意义 。
3. 生物标志物转化和实施挑战：生物标志物的临床转化需要跨学科合作，包括基础科学家、医生、数据分析师和监管机构等，以促进跨学科交流和资源整合 。在进入临床实践之前，需要提供足够的科学证据支持其临床效用，并获得监管机构的批准，然而监管资格认定过程复杂 。监管机构通常基于动物数据制定的方法和标准，可能并不完全适用于新的方法 。此外，实际应用还需要设计合理的临床试验，考虑疾病异质性、患者选择和治疗反应等因素，并且要与现有医疗保健流程相结合，以获得医生和患者的认可 。因此，必须不断培养生物
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4. 生物标志物转化和实施挑战：生物标志物的临床转化需要跨学科合作，包括基础科学家、医生、数据分析师和监管机构等，以促进跨学科交流和资源整合。在进入临床实践之前，需要提供足够的科学证据支持其临床效用，并获得监管机构的批准，然而监管资格认定过程复杂。监管机构通常基于动物数据制定的方法和标准，可能并不完全适用于新的方法。此外，实际应用还需要设计合理的临床试验，考虑疾病异质性、患者选择和治疗反应等因素，并且要与现有医疗保健流程相结合，以获得医生和患者的认可。因此，必须不断培养生物标志物开发者与医生之间的合作，从常规患者就诊或人体临床试验中获取必要证据。
5. 生物标志物的经济和伦理问题：生物标志物的实际应用需要在成本和效用之间取得平衡，特别是在资源有限的医疗环境中，以确保其可持续性。使用生物标志物还可能引发患者隐私和数据安全方面的担忧，尤其是在运用大数据和人工智能技术进行分析时，保障患者隐私和数据安全至关重要。

结论

血浆蛋白质组的复杂性和多样性给开发疾病特异性年龄相关生物标志物表达谱带来了巨大挑战，理解蛋白质功能更是增加了复杂性。在将蛋白质组学整合到临床实践之前，需要解决诸如在儿童中进行大规模研究的困难、确定各年龄组参考范围所需的大量样本，以及将这些信息有效整合到临床实践等问题。虽然将蛋白质组学应用于临床需要时间，但一旦结果得到验证，将其纳入临床实践是可行的。目前，对儿童血浆蛋白质组的研究仍有很长的路要走。

蛋白质组学技术的新突破为小儿脓毒症相关生物标志物的治疗应用带来了广阔前景。新的蛋白质组学技术为研究和治疗小儿脓毒症提供了新的视角和工具。多组学整合是当前蛋白质组学技术的重要发展方向之一，通过将蛋白质组学与基因组学、转录组学和代谢组学等其他组学技术相结合，可以更全面地了解小儿脓毒症的病理生理机制。通过提高检测灵敏度和通量、结合多种技术以及实现多组学整合，这些技术不仅有助于发现新的生物标志物，还为个性化治疗方案的开发提供了更有力的支持。在不久的将来，随着技术的不断改进和跨学科研究的深入整合，新的蛋白质组学技术有望在小儿脓毒症的精准医学中发挥更大的作用。