开发高效表达系统：毕赤酵母生产重组人伴侣蛋白 BiP 的优化与验证

研究人员优化毕赤酵母生产重组人 BiP（rhBiP）的发酵过程，获得高活性蛋白，为其治疗应用提供可能。

　　在细胞的微观世界里，有一种名为 BiP（免疫球蛋白结合蛋白，immunoglobulin binding protein，也称为 78 kDa 葡萄糖调节蛋白，glucose-regulated protein 78，GRP78）的分子伴侣，主要居住在内质网（endoplasmic reticulum，ER）中，它在蛋白质的合成、折叠、组装以及跨内质网转运等过程中发挥着至关重要的作用，就像是细胞内蛋白质生产线上的 “质量监督员”。然而，越来越多的研究发现，BiP 并不局限于内质网，在细胞的其他角落甚至细胞外都能发现它的身影，并且它与多种疾病，如类风湿关节炎、神经退行性疾病等紧密相关，这使得它成为了极具潜力的治疗靶点。但目前，获取重组人 BiP（rhBiP）的技术还不够成熟，无法满足科研和临床试验的需求。

为了解决这一难题，来自维尔纽斯大学（Vilnius University）生物技术研究所的研究人员展开了深入研究。他们的研究成果发表在《Microbial Cell Factories》杂志上，为 rhBiP 的生产和应用开辟了新的道路。

研究人员主要采用了毕赤酵母（Pichia pastoris）表达系统来生产 rhBiP。在实验过程中，运用了多种关键技术方法。首先，通过构建含有目的基因的表达载体，并将其转化到毕赤酵母菌株中，实现 rhBiP 在毕赤酵母中的表达。其次，利用不同的培养基进行发酵实验，探索最佳的发酵条件。最后，采用疏水相互作用、离子交换等色谱技术对表达的 rhBiP 进行纯化和分析。

在研究结果方面：

• rhBiP 在毕赤酵母中的表达：研究人员之前在酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）中表达过 rhBiP，此次在毕赤酵母中，在甲醇诱导型 AOX1 启动子的控制下，利用天然人 BiP 分泌信号进行表达。筛选出的多拷贝 Mut^S表型毕赤酵母克隆 BPp10 在 YEPM 培养基中分泌 rhBiP 的滴度与酿酒酵母相似，达到约 11.8 ± 1.6 mg/L。但在化学限定的基础盐培养基（basal salt medium，BSM）中培养时，rhBiP 的产量较低。
• 摇瓶中 rhBiP 生产的优化：研究人员在摇瓶中对 BSM 培养基中 rhBiP 的分泌进行优化。实验发现，大豆蛋白胨和酵母提取物对 rhBiP 分泌有一定影响，其中大豆蛋白胨中的某些成分可稳定 rhBiP 或增强其分泌。进一步研究发现，添加半胱氨酸可增加 rhBiP 的产量，而添加还原型半胱氨酸性质的二硫苏糖醇（dithiothreitol，DTT）或三（2 - 羧乙基）膦（Tris (2 - carboxyethyl) phosphine，TCEP）同样能显著提高 rhBiP 在 BSM 培养基中的分泌。此外，添加额外的碳源葡萄糖或甘油，在 0.5% - 1.0% 的浓度范围内，可使 rhBiP 滴度提高至约 17 mg/L。最终确定最佳矿物培养基为添加 2 mM DTT 和 0.75% 葡萄糖的 BSM 培养基。
• 生物反应器中 rhBiP 生产的氧限制混合进料发酵策略：在生物反应器中，研究人员采用氧限制葡萄糖 / 甲醇混合进料的发酵策略生产 rhBiP。通过调整甲醇 / 葡萄糖的比例和进料时间，发现每 8 小时注射 0.5%/1.0% 的甲醇 / 葡萄糖混合物为最佳诱导策略，此时 rhBiP 滴度可达约 70 mg/L。
• rhBiP 蛋白的纯化：利用疏水相互作用、凝胶过滤和离子交换色谱技术对发酵培养基中的 rhBiP 蛋白进行纯化。从 1.05 L BSM 生长培养基中获得约 45 mg 的 rhBiP，纯度达到约 90%。
• 毕赤酵母来源的 rhBiP 的表征：质谱数据和 N 端测序证实毕赤酵母来源的 rhBiP 是全长多肽，具有 ATP 酶活性。此外，rhBiP 能有效抑制神经退行性疾病相关的淀粉样 β 1 - 42（Aβ₄₂）肽和 α - 突触核蛋白（α - Syn）的聚集，在体外实验中，1 μM 的 rhBiP 足以抑制 1 μM Aβ₄₂的聚集，5 μM 的 rhBiP 几乎能完全抑制 100 μM α - Syn 的聚集。

在研究结论和讨论部分，研究人员成功开发了一种可扩展的生物工艺，在毕赤酵母中利用化学限定的矿物培养基高效生产 rhBiP。优化后的发酵条件显著提高了 rhBiP 的分泌滴度，为高质量 rhBiP 的生产提供了新途径，有望加速其在治疗神经退行性疾病等方面的应用。同时，该研究也为其他重组蛋白的生产提供了有益的参考，推动了生物制药领域的发展。