改进纳米孔测序技术助力多组分 CRESS-DNA 植物病毒高质量基因组分析

为解决 CRESS-DNA 植物病毒诊断和基因组表征难题，研究人员改进纳米孔测序技术，成果媲美桑格测序。

　　在农业领域，植物病毒可谓是 “隐藏的杀手”，悄无声息地给农作物带来巨大损失。据估计，全球近 50% 的植物病害由病毒引起，每年造成的经济损失高达 300 亿欧元。其中，CRESS-DNA（Circular Rep-encoding Single-Stranded -DNA，环状编码复制相关蛋白的单链 DNA）植物病毒更是危害严重，这类病毒能感染多种植物，从蔬菜到主食作物都深受其害。比如非洲木薯花叶病毒（African cassava mosaic virus，ACMV）会让木薯出现花叶、叶片卷曲等症状，严重影响木薯产量；蚕豆坏死矮化病毒（faba bean necrotic stunt virus，FBNSV）则会侵害蚕豆等作物。

以往，研究人员常用滚环扩增（Rolling Circle Amplification，RCA）结合桑格测序（Sanger sequencing）的方法来研究 CRESS-DNA 病毒。这种方法虽然在揭示病毒多样性方面发挥了重要作用，但存在诸多弊端。它操作繁琐，需要大量的实验室工作，耗费时间长。尤其是在面对多组分病毒或病毒共感染的情况时，效果不佳，很难准确克隆出每个病毒组分，对于低丰度的 DNA 分子更是束手无策。比如纳米病毒的基因组最多可包含 8 个不同的分子，用传统方法进行克隆分析非常复杂。

为了攻克这些难题，来自多个研究机构的人员（包括 The Central and West African Virus Epidemiology (WAVE) for Food Security Program、CIRAD 等）展开了深入研究。他们的研究成果发表在《Virology Journal》上，为 CRESS-DNA 病毒的研究和防控带来了新的希望。

研究人员主要采用了两种关键技术方法。一是滚环扩增结合纳米孔测序（RCA-MinION）技术，对植物样本的 DNA 进行滚环扩增，再利用纳米孔测序仪进行测序；二是运用多种生物信息学分析工具，如用 Guppy v6.5.7 进行碱基识别、NanoPlot v1.41.6 评估序列质量、Diamond2 的 “blastx” 算法进行相似性搜索等，对测序数据进行处理和分析 。

研究结果如下：

• 测序数据及序列质量提升：对木薯和蚕豆样本进行纳米孔测序，获得了大量原始读数。通过利用 RCA 产物的多聚体性质，从多聚体读数中提取串联重复序列（TRs），生成串联重复一致序列（TRC），显著提高了序列质量。例如，木薯样本中 Begomovirus 属病毒读数的多聚体比例为 26.1%，蚕豆样本中 Nanovirus 属病毒读数的多聚体比例为 39.2%。经过处理，Begomovirus 属病毒 TRC 序列的平均 PHRED 质量达到 25.7，Nanovirus 属病毒 TRC 序列的平均 PHRED 质量达到 28.8，相比原始读数质量有大幅提升。
• 序列准确性验证：将 TRC 序列组装后得到的基因组序列与桑格测序结果进行对比。对于 ACMV，MinION 测序得到的 DNA-A 和 DNA-B 组件的一致性序列与桑格测序结果高度相似，仅 DNA-A 组件存在 1 个突变，且该突变在部分桑格测序克隆中也存在。对于 FBNSV，MinION 测序组装的 8 个基因组组件序列与实验用的农杆菌接种克隆序列完全相同，未发现插入 / 缺失（INDEL）、同聚物长度变异（HLV）或替换等突变。这表明改进后的纳米孔测序技术能够准确地获取病毒基因组序列。
• 定量测序潜力探索：通过比较 FBNSV 的 TRC 序列计数和定量 PCR（qPCR）结果，发现两者具有高度相关性，相关系数达到 0.87 。这说明 RCA-MinION 测序在定量基因组分析方面具有一定潜力，不过对于部分病毒片段，如 FBNSV 的 C、R 和 S 片段，由于 RCA 扩增偏差等原因，存在一定的偏差。

研究结论和讨论部分指出，RCA-MinION 方法能够成功恢复具有 2 个和 8 个基因组组件的多组分 CRESS-DNA 病毒的完整基因组，且与桑格测序结果完全匹配。这表明利用最新的纳米孔技术化学和 RCA 产物的多聚体特性，RCA-MinION 测序可作为桑格测序的有效替代方法，用于 CRESS-DNA 病毒的检测和表征。该方法尤其适用于多组分病毒或病毒共感染的研究，且成本较低，即使是生物信息学技能有限的人员也能使用。此外，研究还发现纳米孔测序在研究植物病毒种群组成方面具有潜在应用价值。但目前该方法在定量分析方面还存在一些局限性，需要进一步研究和改进。

总之，这项研究成果为 CRESS-DNA 病毒的研究和防控提供了重要的技术支持和理论依据，有望推动植物病毒学领域的发展，帮助农业生产者更好地应对植物病毒带来的挑战。