传统明场光学显微镜无标记反演成像技术进展

在生命科学和健康医学研究领域，显微镜技术始终是探索微观世界的关键工具。传统明场光学显微镜（Bright-field Optical Microscopy）历史悠久且应用广泛，近年来，因其能够对生物物体进行精确、无标记成像的特性，重新受到科研人员的关注。

一、明场显微镜的原理与弊端

明场显微镜的成像原理是通过样品对光线的吸收、反射和折射来形成图像。当光线透过样品时，不同结构对光的作用不同，从而产生对比度，使我们能够观察到样品的形态。然而，如同任何成像系统一样，明场显微镜存在一些显著的弊端。在成像过程中，相位和振幅相互交织，这使得图像的形成机制较为复杂。当相位物体处于精确焦点时，它们在明场图像中是不可见的，这对于研究一些透明的生物样本，如细胞内的细胞器等，造成了很大阻碍。此外，图像中同时存在正对比度和负对比度，这进一步模糊了样品的真实结构信息，导致对未标记标本的精确成像难以实现。这些问题限制了明场显微镜在生物样本精确成像方面的应用，促使科研人员不断探索改进方法。

二、二维重建方法

为解决明场显微镜在二维成像中的问题，科研人员开发了多种基于传统光学的方法。

（一）离焦显微镜（Defocusing Microscopy）

离焦显微镜通过故意使样品处于离焦状态来获取图像信息。在离焦情况下，样品不同部分的光线传播会发生变化，从而产生独特的图像特征。通过对不同离焦位置的图像进行采集和分析，可以获取更多关于样品结构的信息。这种方法能够在一定程度上分离相位和振幅信息，有助于更准确地重建样品的二维结构。但离焦显微镜也存在一些局限性，例如离焦过程中可能引入额外的像差，影响图像的质量和分辨率。而且，该方法对样品的厚度和光学性质较为敏感，对于厚度不均匀或光学性质复杂的样品，重建效果可能不理想。

（二）强度传输（Transport of Intensity）

强度传输方法是基于光传播过程中的强度变化来获取样品的相位信息。当光通过样品时，强度会随着传播距离和样品的光学特性发生变化。通过测量不同位置的光强度，并利用相关的数学模型，可以计算出样品的相位分布。这种方法能够从明场图像中提取出相位信息，从而改善对相位物体的成像效果。然而，强度传输方法依赖于一些假设条件，如光的传播是近轴的、样品是弱相位物体等。在实际应用中，这些假设可能并不完全满足，导致相位计算的误差，影响重建的准确性。

（三）叠层成像（Ptychography）

叠层成像技术利用相干光照明样品，通过对多个重叠的小区域进行扫描成像，获取丰富的衍射信息。这些衍射信息包含了样品的相位和振幅信息，通过复杂的算法对这些信息进行处理和重建，可以得到高分辨率的二维图像。叠层成像的优势在于能够突破传统显微镜的分辨率限制，提供更清晰的样品细节。但该技术对实验设备和算法要求较高，需要精密的光学系统和强大的计算能力来处理大量的衍射数据。而且，实验过程较为复杂，需要严格控制实验条件，增加了实际操作的难度。

（四）去卷积（Deconvolution）

去卷积是一种数学方法，用于去除显微镜成像过程中产生的模糊和噪声。在明场显微镜成像时，由于光学系统的点扩散函数（PSF）的影响，图像会变得模糊。去卷积通过对测量到的图像和已知的点扩散函数进行反卷积运算，尝试恢复样品的真实结构。这种方法可以提高图像的清晰度和分辨率，增强对样品细节的观察能力。然而，去卷积效果很大程度上取决于点扩散函数的准确测量。在实际应用中，点扩散函数可能会受到多种因素的影响，如样品的不均匀性、光学系统的像差等，导致测量不准确，从而影响去卷积的效果。

三、三维成像技术进展

随着研究的深入，对生物样本进行三维成像的需求日益增长。近年来，在实现三维明场成像方面取得了一系列重要进展。

（一）多视图重建（Multi-view Reconstruction）

多视图重建方法通过从不同角度对样品进行成像，获取多个二维图像。这些图像包含了样品不同方向的信息，然后利用计算机算法将这些二维图像进行融合和重建，从而得到样品的三维结构。这种方法就像是从不同角度给一个物体拍照，然后通过技术手段将这些照片组合成一个立体的模型。多视图重建能够提供较为全面的样品三维信息，但它需要精确的图像配准和复杂的算法来处理大量的图像数据。在实际操作中，样品的移动和成像条件的差异可能会导致图像配准不准确，影响三维重建的精度。

（二）物理建模（Physical Modeling）

物理建模是基于光与物质相互作用的物理原理来构建样品的三维模型。通过对光在样品中的传播过程进行模拟和计算，结合实验测量数据，可以重建出样品的三维结构。这种方法能够充分考虑样品的光学性质和光传播的物理过程，提供较为准确的三维成像结果。然而，物理建模需要对样品的光学参数有较为准确的了解，而获取这些参数往往比较困难。而且，模型的计算复杂度较高，需要强大的计算资源支持，限制了其在实际中的广泛应用。

（三）深度学习（Deep Learning）

深度学习在三维明场成像中也发挥了重要作用。通过构建深度神经网络，让网络学习大量的明场图像数据及其对应的三维结构信息，从而实现从二维明场图像到三维结构的预测和重建。深度学习具有很强的学习能力和适应性，能够处理复杂的图像数据，并且在一些情况下能够取得较好的三维重建效果。但深度学习依赖于大量高质量的训练数据，数据的质量和数量会直接影响模型的性能。此外，深度学习模型的可解释性较差，对于一些对结果解释要求较高的研究场景，可能不太适用。

（四）传统数字图像处理（Conventional Digital Image Processing）

传统数字图像处理技术也被应用于三维明场成像。通过对一系列二维明场图像进行处理，如滤波、增强、分割等操作，然后将处理后的图像进行组合和重建，得到样品的三维图像。这种方法相对简单，易于实现，但在处理复杂样品结构时，可能无法提供足够高的分辨率和准确性。

在这些三维成像技术中，明场显微镜光学切片（Optical Sectioning in Bright-field Microscopy，OSBM）是一种较为直接的方法。它利用标准显微镜采集沿 z 轴方向的图像堆栈（z-image stacks），然后在空间域中应用数字滤波器对这些图像进行处理，从而直接得到三维的反演成像结果。这种方法操作相对简便，不需要复杂的设备和算法，在一些对成像速度和实时性要求较高的研究场景中具有一定的优势。

四、扩展明场显微镜能力的其他技术

除了上述二维和三维成像的改进方法外，还有一些其他技术可以扩展明场显微镜的能力。例如，一些新型的光学元件和照明技术被开发出来，用于改善明场显微镜的成像质量。这些技术通过优化光的传播和照明方式，增强样品的对比度，减少背景噪声，进一步提高明场显微镜对生物样本的成像效果。

传统明场光学显微镜无标记反演成像技术在不断发展和完善。通过各种二维重建方法和三维成像技术的创新，以及其他扩展技术的应用，明场显微镜逐渐成为一种强大的生物物理工具，能够实现对生物样本的精确二维和三维成像。这为生命科学和健康医学领域的研究提供了更有力的手段，有助于科研人员深入探索生物样本的微观结构和功能，推动相关领域的进一步发展。然而，目前这些技术仍然存在一些局限性，未来还需要不断地进行研究和改进，以满足日益增长的科研需求。