综述：天然甜味剂的生物合成与代谢工程

天然甜味剂因环保、健康等特性受关注，本文综述其生物合成途径及微生物生产研究进展。

　　

# 天然甜味剂的生物合成与代谢工程：现状、挑战与展望

一、引言

在人们的日常饮食中，过量摄入糖已成为一个普遍问题。长期高糖饮食可能引发糖尿病、心血管疾病和口腔疾病等。随着发展中国家糖摄入量的持续上升，消费者对低热量、安全的糖替代品需求日益增长，甜味剂应运而生。甜味剂分为天然和人工甜味剂，然而人工甜味剂的安全性和长期健康影响存在争议，还会造成环境污染，如产生含高浓度人工甜味剂的工业废水，影响蚯蚓肠道微生物组成，导致鱼类焦虑等。相比之下，天然甜味剂具有环保、健康、低热量和美味等优点，逐渐受到人们的青睐。

天然甜味剂多为植物或微生物的次生代谢产物，包括萜类（如罗汉果甜苷、甜菊糖苷（SGs）等）、黄酮类（如根皮苷、三叶苷等）、多元醇（如赤藓糖醇、木糖醇、甘露醇等）和甜蛋白（如索马甜、莫奈林、巴西甜蛋白等）。它们不仅安全、低糖、低热量，有助于管理高血糖和肥胖，还具有良好的药理作用，如罗汉果甜苷可缓解湿肺、咳嗽和卵清蛋白诱导的肺部炎症，甜菊糖苷能改善肥胖和糖尿病患者的脂质代谢异常 ，三叶苷对治疗肝脏疾病有益。

但从植物中大规模提取天然甜味剂存在诸多问题，如工艺复杂、成本高、产量低且不环保，部分甜味剂结构复杂，反应条件苛刻，易产生副产物。因此，利用微生物细胞工厂合成天然甜味剂成为研究热点，近年来随着合成生物学的发展，该技术取得了显著进展。

二、天然甜味剂的生物合成途径

（一）萜类

萜类天然甜味剂的生物合成起始于异戊烯焦磷酸（IPP）和二甲基烯丙基焦磷酸（DMAPP），它们可通过甲基赤藓糖醇磷酸（MEP）或甲羟戊酸（MVA）途径生成。

甜菊糖苷中，甜菊苷和莱鲍迪苷 A（Reb A）是主要成分，其合成过程是 IPP 和 DMAPP 在法呢基焦磷酸合酶（FPS）和香叶基香叶基焦磷酸（GGPP）合酶的作用下，依次缩合生成法呢基焦磷酸（FPP）和 GGPP，GGPP 在 ent - 柯巴基焦磷酸合酶（ent - CPPS）和 ent - 贝壳杉烯合酶（ent - KS）等酶的催化下，经多步反应生成贝壳杉烯，再经过细胞色素 P450（CYP450）酶的作用，最终生成甜菊醇，甜菊醇在糖基转移酶（GTs）的作用下形成各种甜菊糖苷。

罗汉果甜苷是一类葫芦烷型三萜皂苷，其合成从角鲨烯在角鲨烯环氧酶（SQE）的催化下生成 2,3 - 氧化角鲨烯，再经一系列反应生成葫芦二烯醇，之后经过羟基化和糖基化修饰形成罗汉果甜苷。

甘草甜素（GL）和甘草次酸（GA）的生物合成也始于角鲨烯，角鲨烯在 SQE 的作用下生成 2,3 - 氧化角鲨烯，再经 β - 香树素合酶（β - AS）催化环化生成 β - 香树素，β - 香树素在 CYP450 酶的作用下经多步氧化生成 GA，GA 再在 UDP - 糖基转移酶的催化下糖基化生成 GL。

（二）甜蛋白

索马甜源自热带植物，有四种形式。其氨基酸序列已被确定，通过克隆索马甜 I 的 cDNA，并在毕赤酵母中表达，可实现其生产。研究发现，索马甜 I 中的一些赖氨酸和精氨酸残基对其甜味起重要作用。

莫奈林由两条独立的肽链组成，其正确的三维结构是产生甜味的前提，高温下两条链会解离失去甜味。单链莫奈林（MNEI）可通过连接两条链获得，具有更好的热稳定性。

巴西甜蛋白由 54 个氨基酸组成，其甜味主要受第 53 位残基影响，N 端缺少焦谷氨酸（pGlu）的形式更甜。

（三）多元醇

木糖醇的生物合成始于戊糖磷酸途径（PPP），葡萄糖 - 6 - 磷酸（G6P）经一系列酶的作用转化为木酮糖 - 5 - 磷酸，再经去磷酸化和还原反应生成木糖醇。

赤藓糖醇的合成主要依赖 PPP，葡萄糖在多种酶的作用下生成赤藓糖 - 4 - 磷酸，再经还原或磷酸化、去磷酸化等反应生成赤藓糖醇。

甘露醇的合成以果糖和葡萄糖为碳源，果糖 - 6 - 磷酸（F6P）可通过不同途径转化为甘露醇，在大多数原核生物中，甘露醇脱氢酶（MDH）以烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（NAD?）为辅因子，而在大多数真核真菌和酵母中，以烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸（NADPH）为辅因子。

（四）黄酮类

根皮苷和三叶苷属于二氢查耳酮（DHCs），通过苯丙氨酸途径合成。苯丙氨酸在苯丙氨酸解氨酶（PAL）、肉桂酸 - 4 - 羟化酶（C4H）和 4 - 香豆酰 - CoA 连接酶（4CL）的催化下转化为对香豆酰 - CoA，再经一系列反应生成根皮素，根皮素在相应的糖基转移酶作用下分别生成根皮苷和三叶苷。

柚皮苷二氢查耳酮（NDC）可由三叶苷在 1,2 - 鼠李糖基转移酶（1,2Rhat）的作用下生成，新橙皮苷二氢查耳酮（NHDC）是由新橙皮苷化学转化而来的强力甜味剂，虽缺乏其天然生产或生物合成的证据，但已有部分研究描述了其生物转化和合成途径。

（五）2′ - 岩藻糖基乳糖（2′ - FL）

2′ - FL 是人类母乳中最丰富的低聚糖，在体内由乳糖和鸟苷 5′ - 二磷酸 - L - 岩藻糖（GDP - L - 岩藻糖）在 α1,2 - 岩藻糖基转移酶的催化下合成。GDP - L - 岩藻糖可通过从头合成或补救途径生成，在大肠杆菌和枯草芽孢杆菌等微生物中均可实现 2′ - FL 的生物合成。

三、天然甜味剂的代谢工程

（一）萜类

在甜菊糖苷的微生物生产中，通过引入异源 MVA 途径和 ent - 贝壳杉烯合成途径，在大肠杆菌中实现了 ent - 贝壳杉烯的生物合成，再通过优化发酵条件和基因表达，提高了甜菊醇和 Reb A 的产量。在酿酒酵母中，通过引入相关基因和优化发酵条件，实现了甜菊糖苷的高效合成，如通过工程化改造蔗糖合酶（SUS）和 SrUGT74G1 突变体，提高了 Rubusoside（Rub）的产量。

对于罗汉果甜苷，在酿酒酵母中重构葫芦二烯醇合成途径，通过过表达相关基因和敲低竞争途径基因，提高了葫芦二烯醇的产量，进而提高了罗汉果甜苷的产量。同时，对糖基转移酶进行改造，可有效合成不同种类的罗汉果甜苷。

在 GL 和 GA 的生产中，通过优化 CYP88D6 和细胞色素 P450 还原酶（CPR）的表达比例，提高了 11 - oxo - β - 香树素的产量，进一步优化代谢途径，实现了 GA 和 GL 在酿酒酵母中的高效合成。

（二）甜蛋白

索马甜在毕赤酵母和大肠杆菌中均有表达，通过优化表达载体、发酵条件和共表达分子伴侣等方式，提高了索马甜的产量和纯度。

莫奈林在大肠杆菌、毕赤酵母、酿酒酵母和枯草芽孢杆菌等多种微生物中均有表达，通过定点突变和优化发酵条件，提高了莫奈林的热稳定性和产量。

巴西甜蛋白在乳酸克鲁维酵母和酿酒酵母中均有表达，通过密码子优化、融合信号肽和优化发酵条件等方式，提高了巴西甜蛋白的产量。

（三）黄酮类

在黄酮类甜味剂的生产中，通过在酿酒酵母中过表达相关基因，提高了根皮素的产量，再通过转染不同的糖基转移酶，实现了根皮苷、三叶苷和 NDC 的生物合成。在大肠杆菌中，通过引入相关基因，提高了三叶苷的产量。

（四）多元醇

在木糖醇的生产中，通过对酿酒酵母进行基因工程改造，如过表达转录因子 Znf1、敲低 BUD21 基因，以及过表达 XYL1 和 XYL2 基因等，提高了木糖醇的产量。利用工业废水发酵生产木糖醇也是一种可行的方法。此外，大肠杆菌和蓝藻等微生物也可用于木糖醇的生产。

赤藓糖醇的生产主要以解脂耶氏酵母为宿主，通过过表达相关基因、敲低竞争途径基因和优化发酵条件等方式，提高了赤藓糖醇的产量。同时，通过共培养和解脂耶氏酵母的固定化技术，也可提高赤藓糖醇的产量。

甘露醇的生产主要利用解脂耶氏酵母、乳酸乳球菌和明串珠菌等微生物，通过优化发酵条件和基因工程改造，提高了甘露醇的产量。

（五）2′ - FL

微生物细胞工厂生物合成是生产 2′ - FL 的主要工业方法。在大肠杆菌中，通过优化 GDP - L - 岩藻糖合成途径、提高乳糖利用效率和优化发酵条件等方式，显著提高了 2′ - FL 的产量。同时，对 α1,2 - 岩藻糖基转移酶进行改造和优化，也可提高 2′ - FL 的产量。在枯草芽孢杆菌和酿酒酵母中，也通过不同的策略实现了 2′ - FL 的生物合成。

四、未来展望

天然甜味剂因具有环保、健康等优势，受到越来越广泛的关注。随着绿色、低碳、可持续发展理念的普及，其市场需求将不断增加。目前，大多数天然甜味剂已可通过微生物细胞工厂从头合成，部分如赤藓糖醇和甘露醇已实现工业化生产，但在生产后期，单一产品的分离和提取仍是一个挑战，且可能造成环境污染，因此需要探索更环保、高效的分离和纯化方法。

此外，大多数从头合成的天然甜味剂产量还不够高，无法满足工业需求。酶的催化效率是限制产量的关键因素，例如 UGT 的催化效率对萜类和黄酮类天然甜味剂的生产至关重要。利用高通量测序和多组学技术挖掘更多高效的 UGT，以及选择合适的微生物宿主，有望提高天然甜味剂的产量。

新兴的基因编辑技术 CRISPR/Cas9 可实现快速、高效、精确的基因编辑，在合成生物学和代谢工程中发挥着重要作用，将其应用于天然甜味剂的生物合成，有望提高微生物细胞工厂的开发效率。人工智能和大数据等技术的发展，也为天然甜味剂的生物合成提供了新的可能性，有助于实现天然甜味剂及其成分的高效全合成。

天然甜味剂的生物合成与代谢工程研究取得了显著进展，但仍面临诸多挑战，未来需要在提高产量、优化生产工艺和开发新的生产技术等方面不断努力，以满足市场对天然甜味剂的需求。