突破！新型罗得草再生转化体系为牧草改良赋能

研究针对热带 C4牧草问题，开发罗得草再生转化系统，为其分子育种奠定基础。

　　

罗得草研究背景：气候变化下的牧草困境与机遇

在全球气候变化的大背景下，畜牧业正面临着前所未有的挑战。占全球农业用地三分之二的牧场，因气候变暖，原本适应温带气候的牧草生长受限， productivity 大幅下降。而热带 C₄牧草，如罗得草（Chloris gayana），因其适应温暖气候、耐干旱等特性，成为了缓解温带牧场压力的潜在 “救星”。罗得草广泛种植于热带地区，有着诸多优良特性，比如耐盐碱、深根习性利于土壤修复 。但它也存在一些问题，其干物质消化率（Dry matter digestibility，DMD）较低，与多年生黑麦草相比，罗得草的 DMD 仅为 54.1 - 55.5%，远低于多年生黑麦草的 74.7 - 86.2%，这使得其营养价值大打折扣，还会导致反刍动物产生更多甲烷排放。

为了提升罗得草的品质，生物技术和植物育种成为了关键手段。然而，此前针对罗得草的生物技术资源有限，相关研究较少，缺乏高效的转化系统成为了制约其基因编辑和品质改良的瓶颈。在此背景下，来自澳大利亚 Agriculture Victoria Research 和 La Trobe University 的研究人员，开展了一项旨在建立罗得草再生和转化系统的研究，该研究成果发表在《Plant Cell, Tissue and Organ Culture (PCTOC)》上。

研究技术方法

研究人员主要采用了以下关键技术方法：首先是组织培养技术，对罗得草种子进行表面消毒后，利用不同的外植体（如切割的中胚轴、分蘖的基部分生组织等）诱导胚性愈伤组织（Embryogenic callus，EC），并通过调整培养基成分和激素浓度，实现愈伤组织的生长、分化和植株再生；其次是基因转化技术，运用粒子轰击法将含有不同选择标记基因（如 bialaphos 抗性基因 bar 和潮霉素抗性基因 hyg）的质粒导入 EC 中；最后，使用数字液滴聚合酶链反应（Digital droplet polymerase chain reaction，ddPCR）对转基因植株进行鉴定和拷贝数分析。

研究结果

1. 可再生基因型筛选与评估：研究人员以商业二倍体罗得草品种‘Tolgar’为材料，发现切割的中胚轴外植体在含有 20μM 2,4 - 二氯苯氧乙酸（2,4 - Dichlorophenoxyacetic acid，2,4 - D）的愈伤组织诱导培养基（Callus induction media，CIM）上，能以 3.89% 的诱导率产生 EC。这些 EC 在芽诱导培养基（Shoot induction media，SIM）上培养 2 - 4 周后可再生出芽，最终获得了四个可生长为植株的‘Tolgar’品系。经过进一步验证，发现 T108 品系在 EC 形成和植株再生方面表现出色，具有良好的重复性，因此被选作后续转化研究的供体材料。
2. 植物转化与选择标记评估：研究使用了两种质粒 pDPI - 77 和 pDPI - 95 进行转化实验，分别携带 bar 和 hyg 选择标记基因。起初评估 bar 选择标记时，发现其转化效率较低（0.34%），且较高浓度的 PPT（如 5mg/L）会抑制转基因植株生长，导致植株出现非生物胁迫和异常生长现象。通过剂量响应实验，确定了 1mg/L PPT 为 CIM 和 SIM 中的适宜浓度，但即使调整了浓度和恢复时间等条件，bar 标记的转化效率仍较低（0 - 0.44%）。而对 hyg 选择标记的初步评估发现，其转化效率相对较高（平均 1.36%，范围 0.41 - 2.16%），但存在部分非转基因芽在筛选过程中存活的问题，说明筛选压力还需进一步优化。
3. 转基因植株的表征：对再生的转基因植株进行 DsRED2 表达筛选和 ddPCR 分析。结果显示，部分转基因植株成功表达了 DsRED2 报告基因，且通过 ddPCR 确定了转基因植株的拷贝数变化（Copy number variation，CNV）。在使用 hyg 筛选的植株中，17% 为单拷贝，42% 为低拷贝（<5）；使用 bar 筛选的植株中，80% 为低拷贝，20% 为高拷贝（≥5） 。单拷贝和低拷贝事件在后续的育种和基因编辑研究中更具优势，因为它们有利于稳定遗传和减少基因沉默。

研究结论与讨论

本研究成功建立了罗得草的再生和转化系统，筛选出了高效的外植体和适宜的选择标记，为罗得草的遗传改良和功能基因组学研究提供了重要的技术支持。通过组织培养获得了稳定的 T108 等可转化品系，确定了 hyg 和 bar 作为选择标记在罗得草转化中的应用潜力，且获得了单拷贝和低拷贝的转基因植株，为后续通过常规转基因和基因编辑手段改良罗得草品质奠定了基础。

然而，研究也发现目前的转化系统仍存在一些问题，如 bar 标记转化效率较低，hyg 筛选时非转基因芽存活较多等，这表明未来还需要进一步优化转化条件，探索其他选择方法和基因传递条件，以提高转化效率和获得更多高质量的转化事件。总体而言，这项研究成果为全球畜牧业中罗得草的利用和改良开辟了新道路，有望通过基因工程手段培育出更优质、更适应气候变化的罗得草品种，提高牧场生产力，减少甲烷排放，推动畜牧业的可持续发展。