在莱茵衣藻中构建功能性甲羟戊酸（MVA）途径，解锁高价值萜类化合物生产新潜能

来自深圳大学等单位的研究人员为解决莱茵衣藻（Chlamydomonas reinhardtii）萜类合成限制问题，构建 MVA 途径，提升了类胡萝卜素产量，为萜类生产提供新平台。

　　萜类化合物（Isoprenoids），又称类萜，是一类结构多样的天然化合物，具有广泛的生物活性，在制药、化工等行业应用广泛。它们均由异戊烯基焦磷酸（IPP）和二甲基烯丙基焦磷酸（DMAPP）衍生而来，而这两种物质可通过甲羟戊酸（MVA）和 2-C - 甲基 - D - 赤藓糖醇 4 - 磷酸（MEP）两条独立的途径合成。

MEP 途径最初在细菌中发现，后来在植物中也有发现，定位于质体，包含 8 个酶促反应。1 - 脱氧 - D - 木酮糖 5 - 磷酸合酶（DXS）、1 - 脱氧 - D - 木酮糖 - 5 - 磷酸还原异构酶（DXR）和异戊烯基异构酶（IDI）通常被视为限速反应的关键酶。研究表明，DXS 是 MEP 途径的首个代谢瓶颈，过表达它可增强碳流入该途径；DXR 在将 1 - 脱氧 - D - 木酮糖 5 - 磷酸（DXP）转化为 MEP 以及调节异戊二烯水平方面至关重要，在缺氮条件下，DXR 表达显著增加，还能刺激三七中皂苷和黄酮类化合物的合成。相较于单个基因的过表达，多个 MEP 途径基因的联合表达对萜类化合物的生产影响更为显著。

MVA 途径最早在动物和酵母中被鉴定，主要存在于细胞质中，因此也被称为细胞质途径。该途径包含 7 个酶促反应，消耗 2 分子还原型辅酶 II（NADPH）和 3 分子三磷酸腺苷（ATP）生成 1 分子 IPP 或 DMAPP。其中的关键酶包括 3 - 羟基 - 3 - 甲基戊二酰辅酶 A 合酶（HMGS）、3 - 羟基 - 3 - 甲基戊二酰辅酶 A 还原酶（HMGR）和甲羟戊酸激酶（MVK）。HMGS 的表达尤为重要，因为其产物 HMG-CoA 具有细胞毒性，高浓度时会抑制脂肪酸合成和细胞生长；粪肠球菌（Enterococcus faecalis）的 HMGS 发生突变，110 位的丙氨酸被甘氨酸取代后，该酶的总反应速率提高了 140 倍。HMGR 在 MVA 途径中起着关键作用，它催化 HMG-CoA 转化为甲羟戊酸，此反应不可逆，是细胞质萜类化合物合成的关键调控节点。MVK 受下游代谢产物（如 DMAPP、IPP、香叶基焦磷酸（GPP）和法尼基焦磷酸（FPP））的负调控，对调节 MVA 途径意义重大。

基因组和蛋白质组分析显示，某些生物，包括大肠杆菌（Escherichia coli）、蓝藻和大多数绿藻，缺乏 MVA 途径，这极大限制了它们天然萜类化合物的合成能力。为解决这一问题，研究人员尝试人工构建 MVA 途径，以增强细胞内 IPP/DMAPP 的合成，促进高价值萜类化合物的生产。在大肠杆菌中，人工 MVA 途径取得了巨大成功，利用来自粪肠球菌的关键酶基因（如mvaS和mvaE）、来自马氏甲烷八叠球菌（Methanosarcina mazei）的mvk基因以及来自肺炎链球菌（Streptococcus pneumoniae）的pmk和pmd基因，实现了近 600mg/L 的异戊二烯产量；使用来自酿酒酵母（S. cerevisiae）的hmgS、hmgR、mvk、pmK和pmD基因，以及内源性Idi和aacT基因，构建人工 MVA 途径的菌株可生产高达 3.6g/L 的柠檬烯。在蓝藻中，人工 MVA 途径也成功实施，使异戊二烯产量提高了 2.5 倍。在植物中，烟草叶绿体中的人工 MVA 途径增加了异戊二烯代谢产物的合成，提高了甲羟戊酸、类胡萝卜素、甾醇、角鲨烯和甘油三酯的产量。

莱茵衣藻（Chlamydomonas reinhardtii）生长需求简单、光合效率高，是合成生物学中极具吸引力的模式生物，且因其无毒，便于进行安全的基因操作和工业应用。然而，莱茵衣藻仅依赖 MEP 途径为叶绿素、类胡萝卜素、甾醇等内源性代谢物的合成提供 IPP 和 DMAPP，这限制了其异源合成萜类化合物的能力。MVA 途径的缺失成为充分挖掘其生物合成潜力的重大挑战。本研究旨在通过将 MVA 途径引入莱茵衣藻，解决这一限制，为高价值萜类化合物的生产带来新变革。

实验所用的莱茵衣藻（UVM4）由 Bock 教授实验室提供，在含有 Tris - 乙酸 - 磷酸（TAP）的培养基中培养，培养条件为光照 / 黑暗周期 16/8h，光通量密度 120μmol m^?2 s^?1，温度 25°C。利用添加抗生素（10μL/mL 的博来霉素，或 10μL/mL 的巴龙霉素和潮霉素）的平板筛选和保存转化体。

研究人员根据先前描述对基因进行优化并合成。MVA 途径分为两个功能模块，即上游模块和下游模块，以中间代谢物甲羟戊酸区分。上游模块基因包括mvaE和mvaS，下游模块基因包括mvk、pmk、mvaD、Idi。目前关于人工 MVA 途径的研究主要使用源自细菌的基因，但鉴于莱茵衣藻是真核生物，本研究选取了两组上游模块基因进行构建。

研究结果显示，通过两步转化策略，研究人员成功在莱茵衣藻基因组中构建了完整且功能正常的 MVA 途径。引入源自粪肠球菌的上游 MVA 模块后，IPP 水平提高了 7 倍（达到 373.75±7.176μg/g DCW），而甲羟戊酸水平变化不显著，这突出了上游 MVA 模块在引导碳流向莱茵衣藻 IPP 合成中的关键作用。随后共转化下游模块基因，使总类胡萝卜素产量提高了 50%。转录组分析表明，参与类胡萝卜素生物合成的基因显著上调，证实了代谢通量向萜类合成的重定向。

萜类化合物在制药、化妆品和食品等行业的需求日益增长，但从天然植物中生物合成萜类化合物成本较高且劳动密集，萜类化合物的分离和纯化也面临诸多挑战，大规模生产用于工业的萜类化合物仍是一大难题。本研究通过在莱茵衣藻中成功构建 MVA 途径，克服了莱茵衣藻代谢的固有局限，为高效、可扩展地生产各种萜类化合物和其他高价值化合物奠定了基础，使莱茵衣藻成为一个强大的生产平台。