揭示 DNA 聚合酶 β 在核小体中填补缺口 DNA 合成的结构基础，为染色质 DNA 修复机制带来新曙光

在细胞中，单链断裂（SSBs）是常见的 DNA 损伤形式，可通过单链断裂修复（SSBR）或碱基切除修复（BER）途径修复，DNA 聚合酶 β（Pol β）在其中起关键作用。但 Pol β 在染色质环境下处理 1 nt 缺口的机制不明。研究人员通过生化分析和冷冻电镜（cryo-EM）研究，发现其利用全局 DNA 塑形机制，为染色质 DNA 修复提供了重要见解。

　　在微观的细胞世界里，DNA 就像一本记录生命遗传信息的 “宝典”，但它却时刻面临着各种 “破坏分子” 的威胁。单链断裂（SSBs）便是其中一种常见的 “破坏” 形式，它在染色质化的基因组中频繁出现。如果这些断裂得不到及时修复，就可能引发一系列严重问题，如基因突变、基因组不稳定，甚至导致细胞死亡。而在修复 SSBs 的过程中，DNA 聚合酶 β（Pol β）扮演着重要角色，它负责处理染色质中 1 nt 缺口这一关键中间步骤。然而，长久以来，科学家们对 Pol β 在染色质环境下处理 1 nt 缺口的具体机制却知之甚少。这就好比知道一把钥匙能开锁，却不清楚它是如何精准地插入锁芯并转动的。为了揭开这个谜团，来自美国堪萨斯大学医学中心等机构的研究人员展开了深入研究。他们的研究成果发表在《Nature Communications》上，为我们理解染色质 DNA 修复机制打开了新的大门。
研究人员采用了多种先进技术来开展此项研究。其中，单周转前稳态酶动力学（STK）用于监测 Pol β 催化单个核苷酸插入到含 1 nt 缺口的核小体（Gap-NCPs）中的效率；电泳迁移率变动分析（EMSA）则用于测定 Pol β 与不同核小体的结合亲和力；冷冻电镜（cryo-EM）技术更是关键，它帮助研究人员获得了 Pol β 与核小体结合的高分辨率结构，直观地观察到它们在微观层面的相互作用。
研究结果如下：

1. Pol β 在核小体中催化位置依赖性核苷酸插入：研究人员构建了 8 种不同位置 1 nt 缺口的核小体，通过 STK 分析发现，Pol β 在核小体中的核苷酸插入效率与缺口位置相关。当缺口靠近核小体的入口 / 出口位点时，插入速率相对较高；而当缺口靠近核小体的二聚体（dyad）时，插入速率显著降低。例如，在 SHL?5.5 位置，Pol β 核苷酸插入速率为0.12±2.7×10?3 s?1 ，相比非核小体的 Gap-DNA 仅下降了 2.5 倍；但在 SHL?1.5 位置，Pol β 几乎无法有效进行核苷酸插入。同时，缺口的旋转取向也会影响插入效率，与溶剂暴露的缺口相比，被组蛋白八聚体遮挡的缺口，Pol β 核苷酸插入速率更低。此外，EMSA 分析表明，Pol β 与核小体的结合亲和力在有 1 nt 缺口时会有所增加，但这种亲和力的差异远小于核苷酸插入速率的差异，说明插入速率的变化并非主要由底物结合亲和力的差异导致。
2. Pol β 识别核小体中 1 nt 缺口的结构基础：利用 cryo-EM 技术，研究人员解析了 Pol β -Gap-NCP?4.5 复合物的结构。发现 Pol β 通过与核小体 DNA 形成广泛的非特异性相互作用来结合 1 nt 缺口，其结合足迹约为 10 bp，主要集中在缺口处，与 5′ - 磷酸和引物末端 3′ -OH 相互作用。在识别缺口过程中，Pol β 会诱导核小体 DNA 发生显著的结构扭曲，包括 5′ - 磷酸和引物末端 3′ -OH 的重新定位，以及核小体 DNA 的弯曲和缠绕变化，这些变化最终使引物末端 3′ -OH 进入聚合酶活性位点，为核苷酸插入做好准备。而且，Pol β 在核小体和非核小体 DNA 中识别 1 nt 缺口和进行缺口填充 DNA 合成的机制相似。
3. 核小体中 1 nt 缺口识别过程中 Pol β 的结构域顺序结合：对 Pol β -Gap-NCP?4.5 的 cryo-EM 数据集进一步分析，发现了两种中间结构状态，即 5′ - 磷酸捕获状态和引物末端捕获状态。这表明 Pol β 在核小体中识别 1 nt 缺口时，可能先通过裂解酶结构域捕获 5′ - 磷酸，然后聚合酶结构域再与引物末端结合，呈现出顺序结合的模式。生化实验也证实，单独的 Pol β 裂解酶结构域就能够与核小体高效结合，并对 1 nt 缺口具有特异性，这与 cryo-EM 观察到的结果一致。
4. Pol β 在核小体不同位置识别 1 nt 缺口的保守机制：研究人员还对 Pol β 在核小体其他位置（SHL?5.5 和 SHL?3.5）识别 1 nt 缺口的机制进行了研究。通过 cryo-EM 获得了相应的复合物结构，发现 Pol β 在这些位置识别 1 nt 缺口和结合核小体的机制与 SHL?4.5 处相似，但随着缺口远离入口 / 出口位点向核小体二聚体移动，核小体 DNA 的位移和扭曲方式有所不同。在 SHL?3.5 位置，Pol β 诱导的核小体 DNA 弯曲需要通过解开近端入口 / 出口处的核小体 DNA 来实现，而在 SHL?5.5 和 SHL?4.5 位置则未观察到这种现象。
   研究结论和讨论部分指出，该研究揭示了 Pol β 在核小体中填补缺口 DNA 合成的分子基础，加深了人们对 SSBR 和 BER 过程中 1 nt 缺口处理的理解。Pol β 通过一种全局 DNA 塑形机制来处理核小体中的 1 nt 缺口，这种机制比之前观察到的上游 BER/SSBR 酶更为广泛。同时，研究还发现 Pol β 的酶活性对 1 nt 缺口在核小体中的位置非常敏感，这可能与核小体结构在不同位置对 Pol β 的限制有关。此外，研究结果表明，在核小体中难以接近的位置，仅靠 Pol β 可能无法高效修复 1 nt 缺口，这暗示了可能需要其他辅助因子来协助 Pol β 完成修复工作。未来的研究可以进一步探讨这些辅助因子与 Pol β 之间的相互作用，以及它们在染色质 DNA 修复过程中的协同机制，这将有助于我们更全面地理解细胞如何维持基因组的稳定性，为相关疾病的治疗和预防提供理论基础。