活细胞中基因编码ε-N-甲基丙烯酰赖氨酸实现蛋白质定点修饰及其功能研究

　　

在生命活动的精密调控网络中，蛋白质翻译后修饰(PTM)犹如分子世界的"密码"，其中赖氨酸酰化修饰近年来备受关注。从常见的乙酰化(Kac)到新发现的巴豆酰化(Kcr)，这些修饰在转录调控、代谢重编程等过程中扮演关键角色。然而，作为Kcr结构异构体的甲基丙烯酰化(Kmea)却长期被忽视——这种由缬氨酸代谢中间体甲基丙烯酰-CoA催化的修饰，目前仅在组蛋白中发现27个位点，其生物学功能特别是非组蛋白中的功能几乎空白。更棘手的是，由于Kmea与Kcr具有相同的质量数(68.023 Da)，传统质谱技术和生化方法难以区分这两种修饰，严重阻碍了相关研究进展。

面对这一技术瓶颈，浙江大学等机构的研究团队在《Nature Communications》发表创新性研究。他们开发了基因密码子扩展技术，首次在活细胞中实现ε-N-甲基丙烯酰赖氨酸(MeaK)的定点掺入，并发现亲环蛋白A(CypA)存在内源性Kmea修饰。通过系统研究CypA K125位Kmea的生物学功能，揭示该修饰通过增强与氧化还原酶相互作用来调控细胞活性氧(ROS)水平，并鉴定HDAC1为关键的Kmea去修饰酶。尤为重要的是，研究还首次发现基因编码的Kmea可在活细胞中被进一步甲基化为ε-N-甲基-ε-N-甲基丙烯酰化(Kmemea)，为PTM研究开辟了新视角。

关键技术方法包括：1) 工程化改造吡咯赖氨酰-tRNA合成酶(PylRS)，建立MeaK在E.coli和哺乳动物细胞的遗传编码系统；2) 亲和纯化联合质谱(AP-MS)分析CypA K125MeaK相互作用组；3) 流式细胞术检测ROS水平；4) 显微尺度热泳动(MST)测定蛋白质-小分子相互作用；5) 基于荧光报告系统的去甲基丙烯酰化酶活性检测。研究使用HEK293T和HeLa细胞系，所有质粒均通过标准分子生物学方法构建。

研究结果部分，"Identification of Kmea in a non-histone protein CypA"显示，通过交联质谱和免疫共沉淀发现CypA与硫氧还蛋白1(TXN1)存在直接相互作用。开放搜索质谱分析鉴定出CypA K125和K131位存在+68.023 Da的质量偏移，经特异性抗体验证确认为Kmea修饰。研究人员提出甲基丙烯酰化肽段特征性环状亚胺离子(Cyclm ion，m/z 152.107)的碎裂路径，为Kmea鉴定提供新依据。

"Genetically encoding Kmea into proteins in E. coli and mammalian cells"部分，团队成功将MeaK定点掺入模型蛋白MBP-Z和EGFP。通过改造MbPylRS(Y349F)和chPylRS(Y384F)，分别在原核和真核系统中实现高效特异的MeaK掺入，完整蛋白质谱和串联质谱证实修饰准确性，特征性Cyclm离子为修饰位点提供决定性证据。荧光激活细胞分选(FACS)显示HEK293T细胞中EGFP Y151MeaK掺入效率达80%以上。

"Comparing interacting proteins of wild-type CypA"揭示，与野生型相比，CypA K125MeaK特异性富集52个相互作用蛋白，主要涉及蛋白二硫键还原酶活性和细胞氧化还原稳态调控。值得注意的是，Kmea修饰显著增强CypA与hnRNP复合物(TDP-43、HNRNPA1等)的相互作用，这些蛋白与肌萎缩侧索硬化(ALS)病理密切相关。

"Methacrylation at K125 repressed the antioxidant capacity of CypA"表明，K125MeaK修饰使CypA丧失抑制ROS的能力，且削弱免疫抑制剂环孢素A(CsA)与CypA的结合。MST测定显示K125MeaK使CsA结合亲和力降低3倍，解释了为何CsA处理不能逆转K125MeaK CypA引起的ROS升高。

"CypA Kmea is regulated by HDAC1"部分，通过构建EGFP K85MeaK荧光报告系统，发现组蛋白去乙酰化酶抑制剂丁酸钠(NaBu)可抑制Kmea去除。AP-MS鉴定HDAC1-3与CypA K125MeaK特异性结合，体外实验证实重组HDAC1能有效去除CypA的Kmea修饰，确立HDAC1为新型去甲基丙烯酰化酶。

最引人注目的发现出现在"Methylation on genetically encoded Kmea"，研究人员在CypA K125MeaK和K131MeaK肽段上检测到-14.016 Da的质量偏移，串联质谱观察到甲基-甲基丙烯酰化特征性线性铵离子(LinIm ion，m/z 183.149)，首次证明基因编码的Kmea可在细胞内被进一步甲基化为Kmemea。这种"修饰上的修饰"为PTM级联调控提供了新范例。

这项研究具有多重重要意义：技术上，建立的MeaK遗传编码系统突破了Kmea与Kcr难以区分的分析瓶颈，为PTM功能研究提供通用策略；机制上，发现CypA Kmea通过HDAC1调控氧化还原稳态，将代谢中间体甲基丙烯酰-CoA与细胞应激响应相联系；临床上，由于甲基丙烯酰-CoA代谢异常与Leigh综合征相关，该研究为这类遗传性神经疾病的治疗提供新靶点。尤为重要的是，发现的Kmemea修饰拓展了对PTM复杂性的认知，提示可能存在全新的修饰调控网络。未来开发特异性Kmemea抗体和交叉链接型非经典氨基酸，将有助于全面揭示这类"超级修饰"的生物学功能。