新型简化结构人工酶高效水解对硝基苯乙酸的突破性进展

研究人员设计新型人工酶 Zn (II)-SMM 水解 PNPA，催化率超非催化体系 5239 倍，为小分子水解酶发展提供思路。

　　在生命科学与化学交叉的前沿领域，酶的研究一直是热点话题。天然酶虽具有高效且特异的催化能力，能精准地驱动各种生物化学反应，但它们也存在一些明显的短板。比如，天然酶的结构往往比较脆弱，在高温、极端 pH 值等较为苛刻的环境条件下，很容易失去活性，这就大大限制了它们在工业生产、生物医学等诸多领域的广泛应用。而且，天然酶的提取和纯化过程不仅复杂，成本还极高，这也成为了大规模应用的一大阻碍。因此，研发性能优异的人工酶来替代或补充天然酶，成为了科研人员们努力攻克的重要课题。

在这样的背景下，吉林师范大学化学学院环境友好材料制备与应用教育部重点实验室的研究人员开展了一项极具创新性的研究。他们致力于设计一种新型的人工酶，期望这种人工酶能够高效地催化对硝基苯乙酸（p-nitrophenyl acetate，PNPA）水解反应，并且在结构上更为简单，稳定性更强。最终，研究人员成功设计出了一种具有简单有机结构的新型人工酶 Zn (II)-SMM，用于 PNPA 的定向水解。该人工酶的催化速率（kcat?/kuncat?）超过非催化体系 5239 倍，这一成果意义重大，为小分子水解酶的设计和发展开辟了新的方向。相关研究成果发表在《Scientific Reports》上。

研究人员在此次研究中运用了多种关键技术方法。在合成方面，通过有机合成方法制备了小分子金属水解酶（SMM），并利用核磁共振（包括¹H NMR、¹³C NMR）和基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱（MALDI-TOF-MS）对其进行结构表征，以确定合成产物的结构正确性。在计算模拟方面，使用 Gaussian 16 A.03 软件包，在 b3lyp/6–31 g (d, p) 水平下进行理论计算，涉及真空和导体极化连续模型，用于研究 SMM 与 Zn²⁺的结合机制。同时，通过 UV-vis 监测实验来研究催化效果，为整个研究提供了多维度的数据支持。

下面来看具体的研究结果：

• 催化效能评估：研究人员选用 PNPA 作为典型底物来评估 Zn (II)-SMM 的催化效能。实验发现，当 PNPA 浓度从 20 μM 增加到 100 μM 时，相较于相同条件下的自发反应，Zn (II)-SMM 催化的反应速率斜率显著增大。即使加入十倍过量的底物，催化水解也能在约 60 秒内完成，这充分显示出该酶体系具有极高的催化效率。通过改变 Zn²⁺浓度测定表观速率常数Kobs?，发现当 Zn²⁺与 SMM 的摩尔比达到 1:1 时，Kobs?逐渐增加至稳定，这表明水解酶复合物 Zn (II)-SMM 由 1 摩尔的 Zn²⁺和 1 摩尔的 SMM 组成。
• 计算洞察：为了深入了解 SMM 与 Zn²⁺的结合机制，研究人员进行了能量模拟计算。结果显示，Zn²⁺采用一种涉及酰氧和氮原子的特征平面结构，在与吡啶上的氮原子形成四面体构型时达到最大稳定性。相较于烷基氧配位，这种构型在能量上更有利，优势达到 99.62 kJ/mol（采用 b3lyp/6–31 g (d, p) 方法通过 Gaussian 软件计算得出）。
• UV-vis 监测催化效果：由于水解酶的主要结构由喹啉衍生物构建，这有助于 PNPA 与金属离子相互作用。研究中，PNPA 水解产生的苯酚在 400 nm 处有 UV 吸收。通过 UV 监测实验发现，随着时间推移，苯酚浓度增加，而去除 SMM 后则没有水解发生，这表明 Zn (II)-SMM 能够与底物结合并促进其水解。
• 动力学研究：详细研究 Zn (II)-SMM 对 PNPA 的催化水解动力学后发现，实验结果呈现出典型的双倒数图和饱和动力学曲线，这证实了其催化活性符合 Michaelis-Menten 方程，说明 Zn (II)-SMM 复合物具有类似酶的特征。计算得到的动力学参数值Kcat?为 0.8287 min?1，水解速率比自发反应快 5239 倍。
• 机制和途径：研究人员评估了 Zn (II)-SMM 体系在不同 pH 水平下的水解速率常数。结果表明，在体系中的 Lewis 酸激活后，金属离子络合物的单羟基形式是 PNPA 水解的有效催化剂。在酸性条件下，Zn (II)-SMM 复合物的吡啶部分容易与 H⁺结合，阻碍底物接近，导致水解反应很少发生。相反，随着 pH 值升高，Zn (II)-SMM 复合物去质子化，使得水能够与 Zn²⁺配位，形成 Zn-OH 键，促进对 PNPA 的亲核攻击，从而加速其水解。在中性条件下，Zn-OH 的催化位点作为一般碱或亲核试剂激活 C-O 羰基键，生成有利于该键断裂和对硝基苯酚释放的过渡态，该机制被认为与单 Lewis 酸激活机制一致。

综合研究结论和讨论部分，此次研究成功设计出一种能够与 Zn²⁺配位的新型小分子有机复合物 Zn (II)-SMM，它可以有效地结合并催化底物 PNPA 的水解。该体系具有模仿金属水解酶催化水解功能的能力，其催化过程符合 Michaelis-Menten 方程，与天然酶类似。并且，该人工金属水解酶 Zn (II)-SMM 体系采用的是单 Lewis 酸激活机制。这些研究成果表明，Zn (II)-SMM 体系是小分子水解酶设计的有前景的候选者，为催化研究提供了便捷途径，更为后续手性金属水解酶的研究奠定了坚实基础，有望在生物催化、药物合成等多个领域发挥重要作用，推动相关领域的进一步发展。