化学遗传学诱导 CA1 区超兴奋性揭示 Ambra1 与性别对自闭症易感性的影响

为探究 Ambra1 水平及性别对自闭症易感性的影响，研究人员对小鼠实验，发现二者不影响自闭症反应性。

　　自闭症谱系障碍（Autism Spectrum Disorders，ASD）是一类神经发育障碍性疾病，患者在行为上表现出感觉和注意力缺陷、运动刻板以及社交能力下降等特征。这些行为改变与大脑中 GABA 能或谷氨酸能神经传递受损有关，进而打破了兴奋性 / 抑制性（E/I）平衡，导致大脑皮层、海马体和小脑等区域出现过度兴奋的情况。在众多与 ASD 相关的基因中，Ambra1 基因（编码 Beclin1 调节自噬激活分子）因其杂合缺失会在小鼠中引发性别二态性的自闭症样特征而备受关注。具体来说，Ambra1^+/-雌性小鼠会出现社交和注意力障碍等问题，而雄性小鼠却对这种突变不敏感。

尽管遗传因素在 ASD 病因中起着重要作用，但环境因素同样不可忽视。许多外部事件，如出生时的不良状况、围产期接触毒素以及早期经历压力或创伤性事件等，都可能导致大脑过度兴奋，进而引发 ASD 症状。然而，目前仍不清楚那些携带 ASD 易感性因素但未表现出症状的小鼠，在面对增强海马体兴奋性的外部事件时，是否会出现自闭症样特征，以及 Ambra1 水平的变化和性别差异在其中起到怎样的作用。

为了解开这些谜团，来自 IRCCS Santa Lucia Foundation、罗马大学等机构的研究人员开展了相关研究。他们的研究成果发表在《Translational Psychiatry》上，为深入理解 ASD 的发病机制提供了重要线索。

在这项研究中，研究人员运用了多种技术方法。首先是动物实验，他们选用成年（2 - 3 个月）的雄性 PV-Cre_Ambra1^+/-（PV_A）小鼠和其同窝的野生型（PV_Wt）小鼠，这些小鼠是通过 Ambra1^+/-雄性小鼠与表达 Cre 重组酶的纯合 PV-Cre^+/+雌性小鼠杂交获得的。接着进行化学遗传学实验，通过向小鼠海马体背侧 CA1 区注射不同的病毒载体，实现对神经元活动的精准调控。同时，运用蛋白质免疫印迹（Western blot）技术检测海马体中 Ambra1 蛋白的表达水平；利用电生理记录技术记录神经元的电活动；通过行为学测试评估小鼠的社交和注意力能力；借助免疫荧光和共聚焦显微镜技术观察神经元的形态和标记物表达。

研究结果如下：

1. PV_Ambra1^+/-小鼠的特征：Ambra1^+/-小鼠与 PV-Cre 转基因小鼠杂交后，成功获得了可用于选择性操纵 PV 中间神经元（PV-IN）活动的 Ambra1_PV-Cre（PV_A）和 Wt_PV-Cre（PV_Wt）小鼠。研究发现，PV_Wt 雄性小鼠的 Ambra1 表达水平本就低于雌性，而 PV_A 小鼠的 Ambra1 表达整体低于 PV_Wt 小鼠，且 PV_A 雄性和雌性小鼠之间无差异。同时，在向小鼠海马体背侧 CA1 区注射 AAV-hSyn-DIO-hM4Di-mCherry 后，约 75% 表达 PV 的中间神经元显示出 mCherry 表达，证明了病毒载体能有效靶向 PV 中间神经元。
2. 化学遗传学抑制 PV-IN 对 GABA 能电流的影响：为验证 CNO 诱导的对 PV-INs 的化学遗传学抑制作用，研究人员记录了 PV_A 和 PV_Wt 雄性小鼠 CA1 锥体神经元（PN）的外周诱发抑制性突触后电流（eIPSCs）。结果发现，CNO 处理后，PV_A 和 PV_Wt 雄性小鼠的 eIPSCs 幅度均降低，同时微型抑制性突触后电流（mIPSCs）的频率和 / 或幅度也有所下降，这表明激活抑制性 DREADD 可选择性阻断 PV-IN 的抑制活性，且该效果不受基因型影响。
3. 急性化学遗传学抑制 PV-IN 对雄性小鼠行为的影响：尽管 Ambra1 单倍体不足本身不足以在雄性小鼠中诱导出 ASD 特征，但研究人员推测它可能使雄性小鼠在面对增加海马体兴奋性的事件时更易出现自闭症样表型。通过行为学测试发现，在注射 CNO 激活抑制性 DREADD 后，PV_A 和 PV_Wt 雄性小鼠在三室（TC）测试、新物体识别（NOR）测试和成对社交互动（SIP）测试中均表现出社交新奇性和物体识别能力受损，社交互动时间减少，且这些行为变化在不同基因型的雄性小鼠中相似，说明 Ambra1 水平的轻度下调并未使雄性突变小鼠潜在的 ASD 风险增加。
4. 长期化学遗传学抑制 PV-IN 对雄性小鼠树突棘的影响：树突棘形态异常是神经发育障碍的一个内表型。研究人员对 CNO/ Veh 饮用的 PV_A 和 PV_Wt 雄性小鼠进行树突棘测量，发现 CNO 处理组小鼠的树突棘数量均增加，且不成熟细棘的比例上升，成熟蘑菇棘的比例下降，表明海马体过度兴奋会引发典型的 ASD 样树突棘变化，而 Ambra1 下调并不会加剧这种变化。
5. 化学遗传学抑制 PV-IN 对野生型雌性小鼠的影响：研究人员在野生型 PV_Wt 雌性小鼠中进行相同的操作，发现 CNO 注射同样降低了 PV_Wt 雌性小鼠的 eIPSCs 和 mIPSCs 幅度。行为学测试和树突棘分析结果显示，CNO 处理的 PV_Wt 雌性小鼠表现出与 CNO 处理的 PV_Wt 雄性小鼠相似的自闭症样行为和树突棘异常，说明性别差异在化学遗传学诱导的自闭症样特征中影响较小。
6. 化学遗传学增加 CA1 PN 活性的影响：为进一步证实 PV-IN 在调节 CA1 兴奋性和引发自闭症中的关键作用，研究人员向 Ambra1^+/-雄性小鼠和野生型小鼠的 CA1 区注射表达激活型 hM3Dq 受体的 AAV。结果发现，CNO 注射后，所有小鼠在 TC 测试和 NOR 测试中均表现出社交新奇性和物体识别能力受损，与化学遗传学抑制 CA1 PV-IN 活性引发的结果相似，表明增强 CA1 PN 活性同样能触发类似的社交和注意力缺陷。

研究结论和讨论部分指出，本研究表明 Ambra1 基因在雄性突变小鼠中的下调以及野生型小鼠中 Ambra1 水平的性别差异，均不会导致对化学遗传学诱导的特发性 ASD 的反应性出现差异。这意味着在环境驱动的特发性 ASD 中，性别因素的作用相对较小。同时，研究还发现 CA1 区的 GABA 能 PV-IN 虽然在海马体中间神经元中占比仅 25%，但对调节海马体网络活动起着精细的调控作用，且 PV-IN 和 PN 可作为治疗海马体过度兴奋的潜在靶点。此外，研究也提出未来还需进一步研究早期发育过程中不良条件对 ASD 风险的影响，例如将无症状小鼠暴露于围产期应激、神经毒素或促炎因子等环境中，以更深入地了解非致病性 Ambra1 波动如何增强特发性 ASD 风险。总的来说，这项研究为 ASD 的研究提供了新的视角和方向，有助于推动针对 ASD 的精准诊断和治疗策略的发展。