基于二代测序技术助力儿童侵袭性肺曲霉病精准诊断

为解决儿童侵袭性肺曲霉病（IPA）诊断难题，研究人员开展基于二代测序（NGS）的曲霉检测研究，优化了检测流程，有助于提升诊断准确性。

　　在免疫功能低下的儿童群体中，侵袭性肺曲霉病（Invasive Pulmonary Aspergillosis，IPA）就像一个隐藏在暗处的 “杀手”，时刻威胁着孩子们的健康。目前，诊断 IPA 面临着诸多挑战。传统的诊断方法，如影像学检查、微生物支气管肺泡灌洗液（Bronchoalveolar Lavage，BAL）分析（包括培养、抗原检测和 PCR）以及血清抗原检测，虽然有一定价值，但都存在明显的局限性。例如，BAL PCR 的灵敏度仅为 0.17%（95% CI，0.05 - 0.45） ，BAL 半乳甘露聚糖（Galactomannan，GM）检测的灵敏度虽有 60%，却无法在物种水平上进行区分，难以准确鉴别侵袭性曲霉病与其他非曲霉属真菌感染 。而且，儿科患者常常提前接受抗真菌治疗，这进一步影响了这些微生物检测方法的性能。正因如此，寻找一种更灵敏、准确且能在物种水平诊断 IPA 的方法迫在眉睫。

来自荷兰多家研究机构，包括乌得勒支大学医学中心（University Medical Center Utrecht）、公主玛克西玛儿童肿瘤中心（Princess Máxima Center for Pediatric Oncology）等的研究人员，开展了一项旨在推进基于液体活检的二代测序（Next-Generation Sequencing，NGS）技术用于曲霉检测临床评估的研究。该研究成果发表在《npj Genomic Medicine》杂志上，为 IPA 的诊断带来了新的希望。

研究人员主要采用了以下关键技术方法：首先，对 46 个不同的液体活检样本（包括血浆和 BAL 液）进行高通量测序，构建了 60 个测序文库；其次，利用 Illumina 测序模拟器 ReSeq 模拟了 87 个 cfDNA 样数据集，用于评估数据库和分类阈值对曲霉分类准确性的影响；最后，开发了开源的 cfDNA 病原体识别流程 cfSPI（cell-free DNA Single-strand Pathogen Identification pipeline），该流程整合了多种生物信息学工具，如 Bowtie2 用于宿主读段比对、kraken2 用于分类学分类，并对多个关键步骤进行了优化。研究样本队列来源于 2020 年至 2023 年在公主玛克西玛儿童肿瘤中心被诊断为 IPA 的免疫功能低下的儿科患者，同时纳入了免疫功能低下但未患 IPA 的儿科患者作为外部对照。

下面来看看具体的研究结果：

• 优化宿主读段扣除和 kraken2 数据库组成：研究发现，将测序读段映射到人类参考基因组 GRCh38.p14 或 CHM13v2.0 时，双映射（同时映射到 GRCh38.p14 和 CHM13v2.0）策略可显著减少未映射读段的比例，从 2.27% 分别降至 1.77% 和 1.71%，同时降低真菌分类读段的数量，有效避免真菌计数的高估。此外，将 CHM13v2.0 纳入 kraken2 使用的标准 NCBI RefSeq 数据库中，可减少人类读段被误分类为真菌的情况。在评估新构建的 kraken2 数据库时，发现中等规模包含 21 - 31 个曲霉基因组的数据库（如 cRE.21）对物种水平检测灵敏度最高（平均 53.8%），而较大规模包含 258 - 260 个基因组的数据库（如 dREM.260）在属水平检测上表现更优（平均 73.6%）。因此，cfSPI 流程中使用 cRE.21 进行物种鉴定，dREM.260 进行属鉴定。
• 优化样本处理：在样本处理方面，研究比较了单链（Single-Stranded，ss）和双链（Double-Stranded，ds）连接方法以及无细胞 DNA（Cell-Free DNA，cfDNA）和全细胞 DNA（Whole-Cell DNA，wcDNA）测序的效果。结果显示，ss 连接方法在从血浆和 BAL 样本中回收真菌 DNA 方面比 ds 连接更有效，且 cfDNA 中真菌和曲霉的丰度显著高于 wcDNA。此外，BAL 液中 cfDNA 的真菌计数平均比血浆样本高 5.4 倍，这可能与 BAL 液直接在曲霉感染的假定部位采样有关。
• 优化置信阈值：研究人员通过计算理论最低显著检测限（Limits of Significant Detection，LoSD），探索了真菌背景水平、分类率与检测曲霉所需的理论最低分子数（Molecules Per Million，MPM）之间的关系。结果表明，基于血浆样本，使用 cRE.21 进行物种水平检测时，kraken2 的最佳置信阈值为 0.4；使用 dREM.260 进行属水平检测时，最佳置信阈值为 0.9。在此条件下，使用 cRE.21（CT = 0.4）可在所有 20 个模拟的曲霉数据集中检测到高达 4 MPM 的曲霉物种水平；使用 dREM.260（CT = 0.9）时，在 93% 的血浆和 BAL ss - cfDNA 模拟样本中可检测到≤4 MPM 的曲霉属水平。
• 诊断性能评估：研究人员对 7 例符合条件的 IPA 患者进行了回顾性原理验证研究。结果显示，与 18 个外部对照样本相比，5/7 的 IPA 患者 BAL 样本和 3/5 的血浆样本中烟曲霉（A. fumigatus）水平显著升高，且 18 个外部对照样本均未检测到阳性结果，表明 ss - cfDNA NGS 检测具有较高的特异性。在 7 例患者中，6 例至少在一种液体活检样本中检测到曲霉阳性，cfSPI 流程在检测曲霉方面展现出了潜在的优势，如在患者 A03 中，cfSPI 是唯一能检测到曲霉的分子检测方法，而标准的真菌分子诊断方法则未能检测到。

综合研究结论和讨论部分，该研究通过优化 NGS 流程中的多个关键步骤，包括宿主读段扣除、数据库组成、样本处理和置信阈值等，显著提高了基于液体活检的曲霉检测准确性。同时，研究还发现 ss - cfDNA 测序在检测真菌 cfDNA 方面优于 wcDNA 测序，为临床诊断 IPA 提供了更可靠的方法。然而，研究也存在一定的局限性，如患者样本量较小，限制了对其他曲霉物种检测效果的评估，且无法与传统诊断方法进行全面比较。未来，需要更大规模的外部验证队列来进一步验证该流程的临床适用性。但无论如何，这项研究为真菌 NGS 研究奠定了重要基础，有望推动 NGS 技术在侵袭性霉菌病（Invasive Mold Disease，IMD）诊断中的广泛应用，从而提高免疫功能低下患者 IPA 的诊断准确性，为临床治疗提供更精准的依据，拯救更多儿童患者的生命健康。<该研究还为后续研究指明了方向。一方面，通过进一步优化数据库和分析流程，有望提高对不同曲霉物种的检测能力，实现更精准的诊断。另一方面，结合更多临床样本和长期随访数据，能够更深入地了解曲霉感染的动态变化，为临床治疗方案的制定和调整提供更有力的支持。同时，研究人员开发的开源 cfspi 流程，方便其他科研人员使用和改进，促进了整个领域的发展，使得基于 ngs 的曲霉检测技术能够更快地从实验室走向临床实践。 cfspi 流程，方便其他科研人员使用和改进，促进了整个领域的发展，使得基于 ngs>