靶向 β-catenin 依赖的 PPAT 上调驱动的新嘌呤生物合成：肝母细胞瘤治疗新策略

为探究肝母细胞瘤（HB）中嘌呤生物合成机制，研究人员发现 β-catenin 上调 PPAT 促进 HB 进展，为 HB 治疗提供新方向。

　　# 靶向新嘌呤生物合成：肝母细胞瘤治疗的新曙光
在儿童肿瘤的世界里，肝母细胞瘤（Hepatoblastoma，HB）是一种常见且危险的胚胎性恶性肝癌，如同隐藏在孩子们身体里的 “定时炸弹”。它起源于异常的干细胞或肝祖细胞，约占儿科肝脏肿瘤的 80% 。尽管目前通过手术和新辅助化疗的联合治疗，部分 HB 患者的预后有所改善，但对于那些晚期出现转移或对化疗耐药的患儿来说，情况依旧不容乐观，他们的 5 年生存率不到 40% 。因此，深入了解 HB 进展的分子机制，寻找新的治疗策略，成为了医学领域亟待解决的难题。

在众多与 HB 相关的研究中，Wnt/β-catenin 信号通路备受关注。大约 50 - 90% 的 HB 患者携带 CTNNB1 基因的激活突变，该基因编码 β-catenin。这种突变使得 β-catenin 蛋白更加稳定，大量转移并积累在细胞核中，与 TCF/LEF 转录因子结合，驱动许多靶基因的转录激活，进而促进肿瘤的发生和发展。同时，肿瘤细胞的代谢改变也是其显著特征之一，核苷酸的生物合成和利用对于具有不同遗传背景的癌细胞来说至关重要。嘌呤核苷酸的生物合成主要有从头合成（De novo purine biosynthesis，DNPS）和补救合成两条途径。DNPS 是一个耗能过程，在非增殖细胞中活性通常较低，但在癌细胞中却被激活，对癌细胞的存活、增殖和耐药起着关键作用，因此成为了极具潜力的治疗靶点。然而，在 HB 中，DNPS 的活性及其驱动 HB 进展的分子机制却鲜为人知。

为了揭开这些谜团，上海交通大学医学院附属上海儿童医学中心等机构的研究人员开展了一系列深入研究。他们的研究成果发表在《Cell Death and Disease》上，为 HB 的治疗带来了新的希望。

研究人员采用了多种关键技术方法。在样本方面，收集了上海儿童医学中心患者的配对 HB 肿瘤样本和相邻正常组织。实验细胞方面，培养了 HuH6、HepG2 等多种细胞系。通过 RNA 提取、逆转录定量 PCR（RT-qPCR）分析基因表达；利用蛋白质免疫印迹（Western blot）分析蛋白水平；运用免疫组织化学（IHC）染色观察蛋白表达定位；借助 CRISPR-Cas9 系统进行基因敲除，以及使用慢病毒转染技术调控基因表达等。此外，还构建了裸鼠皮下移植瘤模型，进行体内实验研究。

研究结果

1. PPAT 高表达可作为 HB 潜在诊断生物标志物：研究人员通过 RNA 测序（RNA-seq）和基因集富集分析（GSEA）发现，HB 标本中嘌呤生物合成相关基因显著上调，尤其是 DNPS 途径中的关键酶 PPAT（phosphoribosyl pyrophosphate amidotransferase）。在多个 HB 患者样本队列以及细胞系实验中都证实，PPAT 的 mRNA 和蛋白水平在 HB 肿瘤组织和细胞系中明显高于正常组织和细胞系。通过受试者工作特征（ROC）曲线分析，发现 PPAT 表达具有良好的诊断价值（AUC = 0.9043，p < 0.0001）。此外，基于肝癌数据集的生存分析还提示，PPAT 高表达与患者预后不良相关，这表明 PPAT 水平有望成为 HB 诊断和预后预测的生物标志物。
2. PPAT 对 HB 细胞增殖至关重要：利用 CRISPR-Cas9 技术敲除 HuH6 和 HepG2 细胞中的 PPAT 基因后，细胞增殖受到显著抑制。而补充嘌呤补救途径中的关键碱基次黄嘌呤（Hypoxanthine，HX），几乎能完全恢复因 PPAT 敲除导致的细胞增殖受损。相反，敲除嘌呤补救途径的关键酶次黄嘌呤磷酸核糖基转移酶 1（HPRT1）对肿瘤细胞增殖并无影响，这表明 HB 细胞对 DNPS 途径存在特异性依赖。进一步研究发现，过表达 PPAT 能够显著促进肿瘤细胞生长，且 PPAT 敲除会抑制体内肿瘤生长，这些结果充分证明了 PPAT 在 HB 细胞增殖中的核心作用。
3. PPAT 敲除影响 HB 细胞周期、凋亡和迁移：PPAT 敲除会导致 HB 细胞凋亡率显著增加，细胞周期停滞在 G₁/S 期。同时，DNA 损伤反应（DDR）相关生物标志物 γ-H2AX 和 p-CHK2（Thr68）以及凋亡标记物 cleaved PARP 的水平显著升高，而补充 HX 可使这些指标恢复到正常水平。在细胞迁移实验中，PPAT 敲除显著抑制了 HuH6 和 HepG2 细胞的迁移能力，补充 HX 后迁移能力得以恢复，过表达 PPAT 则增强细胞迁移能力，这表明 PPAT 对 HB 细胞迁移也起着重要作用。
4. PPAT 表达与 Wnt/β-catenin 信号通路激活相关：GSEA 分析发现，HB 标本中 Wnt/β-catenin 信号通路相关基因显著富集。研究人员检测到 HB 患者样本中 β-catenin 及其下游靶基因 Axin2 的 mRNA 和蛋白水平均明显升高，且在 HB 细胞系中也有类似现象。进一步分析发现，PPAT 与 CTNNB1 基因表达之间存在显著正相关，在携带 CTNNB1 激活突变的患者中，PPAT 表达更高。这一系列结果表明，Wnt/β-catenin 信号通路的激活与 PPAT 表达密切相关。
5. β-catenin 转录上调 PPAT 表达并刺激 DNPS：通过 shRNA 敲低 β-catenin 表达后，PPAT 的 mRNA 和蛋白水平均显著下降。研究发现，PPAT 启动子区域存在 6 个 TCF/LEF 结合位点，双荧光素酶报告基因实验表明 β-catenin 能够增强 PPAT 启动子驱动的荧光素酶表达，且突变结合位点后这种增强作用明显减弱。染色质免疫沉淀定量 PCR（ChIP-qPCR）实验进一步证实 β-catenin 能够直接结合到 PPAT 启动子区域。稳定同位素示踪实验表明，敲低 β-catenin 会显著抑制 DNPS 途径中同位素标记的 IMP、AMP 和 GMP 的从头合成，说明 β-catenin 通过转录上调 PPAT 表达，进而刺激 DNPS。
6. 靶向 DNPS 可抑制 HB 进展：基于上述研究，研究人员推测靶向 DNPS 可能是抑制 HB 进展的有效治疗策略。洛美曲索（Lometrexol，LTX）能够特异性抑制 DNPS 途径中的 GART 酶活性，阻断 DNPS。体外实验表明，LTX 可显著诱导 HB 细胞凋亡，使细胞周期停滞在 G₁/S 期，抑制细胞迁移，且这些作用可被 HX 逆转。体内实验利用 HB 裸鼠移植瘤模型也证实，LTX 能够有效抑制肿瘤生长。这表明靶向 DNPS 的药物如 LTX，对激活突变 β-catenin 驱动的 HB 具有潜在治疗价值。

研究结论与意义

该研究揭示了激活的突变 β-catenin 信号通过上调 PPAT 表达增强 DNPS，在 HB 细胞的增殖和迁移中发挥关键作用。PPAT 作为 DNPS 的限速酶，其高表达对 HB 肿瘤细胞的生长、迁移和进展至关重要，而 β-catenin 则是 PPAT 表达的关键转录激活因子。这一发现为 HB 的治疗提供了新的潜在靶点和治疗策略，即针对 DNPS 途径的药物如 LTX，有望成为治疗携带激活 β-catenin 突变的 HB 患者的有效手段。此外，该研究也为其他可能存在类似代谢异常的癌症治疗提供了思路和参考，进一步拓展了 DNPS 作为肿瘤治疗靶点的研究领域。未来，或许可以基于这些发现，开发更多针对 HB 及相关癌症的精准治疗方案，为癌症患者带来更多希望。