EI 在大肠杆菌（Escherichia coli）细胞极区形成簇，其亚细胞定位和活性受 TmaR（先前称为 YeeX）调控。TmaR 可将 EI 隔离在极区，使其在不需要时保持无活性状态，需要时再释放。TmaR 能形成无膜细胞器，EI 被包含在其中，这种相分离现象对 EI 的调控具有重要意义。本研究旨在探究 EI-TmaR 的相互作用模式及其对 EI 活性的影响，通过结合遗传和自动化显微镜筛选，确定二者相互作用和共定位的关键残基，构建相互作用模型，为深入理解细菌糖代谢调控机制提供依据。
研究方法与实验设计
为了实现研究目的，研究人员设计了一系列实验。首先，构建 EI 突变体文库，通过易错 PCR 对编码 EI 的ptsI基因进行随机突变，并将其与 mCherry 融合，导入缺失pts操纵子的大肠杆菌细胞中。在 MacConkey - 葡萄糖指示平板上筛选能消耗葡萄糖的菌落，再通过高通量自动荧光显微镜筛选出不再定位于极区但仍具有调节糖消耗功能的 EI 突变体。同样地，构建 TmaR 突变体文库，将融合 YFP 的tmaR基因随机突变后导入缺失tmaR基因且表达 EI - mCherry 的细胞中，通过荧光显微镜筛选出能定位于极区但无法招募 EI 的 TmaR 突变体。
EI 功能突变体的筛选与鉴定：经过筛选，获得了 6 个不再定位于极区但功能正常的 EI 突变体。序列分析发现，这些突变体的突变位点集中在 EIC 起始区域，靠近连接两个结构域的 linker，且多数突变位于 EI 表面。其中，甘氨酸 266（G266）的突变尤为关键，该位点被不同氨基酸取代后，EI 无法定位于极区，但仍能调节糖消耗。进一步研究表明，G266 对 EI 的柔性至关重要，其突变影响了 EI 与 TmaR 的相互作用。
TmaR 突变体的筛选与鉴定：从 1152 个 TmaR - YFP 变体中，筛选出 17 个能定位于极区但不能招募 EI 的突变体。测序分析发现，这些突变体的突变位点集中在两个区域，分别位于 TmaR 的 N 端和 C 端附近，通过构建 TmaR 结构模型，发现这些突变位点位于其两个 α 螺旋上，且侧链朝外。
突变对 EI - TmaR 相互作用的影响：通过共免疫沉淀（coIP）、细菌双杂交实验和远 - western 分析等方法，研究发现筛选出的 EI 和 TmaR 突变体均显著削弱了二者的相互作用。在酵母细胞中的实验表明，这些突变体影响了 EI - TmaR 的共相分离，进一步证实了突变对二者相互作用的破坏。
TmaR 突变对 EI 活性的影响：研究发现，TmaR 突变体对 EI 活性有显著影响。带有 patch I 突变的 TmaR 完全丧失了与 EI 的相互作用和隔离能力，导致 EI 介导的糖消耗增加；patch II 突变体与 EI 的相互作用部分受损，对 EI 活性的调节也存在部分缺陷。
EI - TmaR 相互作用模型的构建与验证：利用 ClusPro 和 AlphaFold 等工具，结合实验数据，构建了 EI - TmaR 相互作用模型。该模型表明，TmaR 的 patch I 与 EI 的相互作用较为关键，patch II 起到稳定作用。通过对预测相互作用位点的突变实验，进一步验证了模型的合理性。同时，共进化分析和不同物种间的实验表明，EI - TmaR 的相互作用在进化上具有保守性。
研究结论与意义
本研究通过一系列实验，成功揭示了 EI - TmaR 的相互作用模式。TmaR 通过其两个特定区域与 EI 相互作用，稳定 EI 的二聚体形式，阻止其与 HPr 结合，从而抑制 EI 的活性。这种相互作用在进化上高度保守，对细菌糖代谢的调控至关重要。研究还发现，EI 的 G266 位点虽不直接与 TmaR 相互作用，但对 EI 的柔性和与 TmaR 的结合能力具有重要影响。此外，研究人员提出的研究方法，即结合高通量筛选、3D 分子建模和共进化分析，为揭示蛋白质间相互作用介导的调控机制提供了新的思路，有助于深入理解细菌细胞内信号转导通路的空间调控，为相关领域的研究开辟了新方向。
研究的局限性
尽管本研究取得了重要成果，但仍存在一些局限性。例如，筛选实验未完全饱和，且突变体选择是手动进行的，可能忽略了一些中间相互作用。此外，由于筛选条件的限制，无法确定 EI 在未磷酸化状态下与 TmaR 的相互作用情况。同时，研究不能排除存在第三参与蛋白的可能性，也未确定 EI - TmaR 相互作用的亲和力和动力学，其相互作用模型还需进一步通过结构分析验证。
