《Cell》淋巴细胞活化基因 3（LAG3）免疫检查点功能的新机制及潜在生物标志物

在癌症免疫治疗的广阔领域中，淋巴细胞活化基因 3（LAG3）宛如一颗备受瞩目的新星，成为极具潜力的治疗靶点。近年来，随着免疫治疗的蓬勃发展，LAG3 逐渐走进人们的视野，相关药物研发不断推进，为癌症患者带来了新的希望。然而，就像神秘的宝藏被层层迷雾所笼罩，LAG3 在配体结合后激活的机制却一直是个未解之谜，这严重阻碍了相关研究的深入开展和精准治疗的进一步优化。在这个背景下，上海科技大学生命科学与技术学院等多机构的研究人员他们精心设计并开展了一系列深入研究，最终取得了令人瞩目的成果，相关论文发表在《Cell》杂志上。

　　

在癌症免疫治疗的广阔领域中，淋巴细胞活化基因 3（LAG3）宛如一颗备受瞩目的新星，成为极具潜力的治疗靶点。近年来，随着免疫治疗的蓬勃发展，LAG3 逐渐走进人们的视野，相关药物研发不断推进，为癌症患者带来了新的希望。然而，就像神秘的宝藏被层层迷雾所笼罩，LAG3 在配体结合后激活的机制却一直是个未解之谜，这严重阻碍了相关研究的深入开展和精准治疗的进一步优化。

在这个背景下，上海科技大学生命科学与技术学院等多机构的研究人员挺身而出，决心揭开 LAG3 激活机制的神秘面纱。他们精心设计并开展了一系列深入研究，最终取得了令人瞩目的成果，相关论文发表在《Cell》杂志上。

研究人员运用了多种先进的技术方法。在样本研究方面，使用了 OT - I、OT - II TCR 转基因小鼠以及构建的 LAG3 基因敲入小鼠等动物模型，还对黑色素瘤患者等临床样本队列进行分析。在检测技术上，质谱分析（MS）用于鉴定 LAG3 的泛素化位点和修饰类型；核磁共振（NMR）光谱技术探究 LAG3 与细胞膜的相互作用；流式细胞术检测细胞表面分子表达和细胞内细胞因子分泌情况。通过这些技术，从多个角度对 LAG3 的功能机制展开研究。

下面来看具体的研究结果。

1. MHC II 介导的配体结合触发 T 细胞激活过程中 LAG3 的快速泛素化：研究人员利用 T 细胞 - APC 共培养系统，将人类 LAG3 异位表达于 Jurkat T 细胞，与表达 MHC II 的 Raji B 细胞共培养并刺激 TCR。MS 分析发现，激活的 T 细胞中 LAG3 的 K498 位点发生泛素化，而静止 T 细胞中没有。进一步研究表明，LAG3 泛素化具有时间依赖性，抗原刺激后 2 分钟即可检测到，5 分钟达到高峰，30 分钟基本恢复到基础水平。同时，与 MHC II 结合缺陷的突变体 LAG3^P115A不能发生泛素化，而阻断 LAG3 与 MHC II 结合的 relatlimab 也能完全阻断 LAG3 泛素化，这充分证明 LAG3 泛素化依赖于配体结合。此外，通过构建敲入小鼠模型，证实了在小鼠 CD4 和 CD8 初级 T 细胞中，抗原刺激同样会导致 LAG3 大量泛素化，且 K490（相当于人类 K498）是关键的泛素化位点。

2. 膜结合型 FGL1 而非可溶性 FGL1 诱导 LAG3 泛素化：FGL1 作为 LAG3 的配体存在争议，研究人员对此进行探究。他们用表达内源性 LAG3 的 OTI T 细胞与不同的 APC 共培养，发现 FGL1 - Fc 诱导的 LAG3 泛素化较弱，且这种泛素化依赖于膜结合。当使用 Fc 受体阻断抗体或 His - FGL1 时，LAG3 泛素化显著受到抑制。同时，FGL1 - Fc 能够以 LAG3 依赖的方式抑制 IL - 2 的产生，这表明 FGL1 需要呈现在 APC 膜上才能作为 LAG3 的配体发挥作用。

3. LAG3 泛素化不诱导降解，而是正向调节 LAG3 功能：通常情况下，配体诱导的受体泛素化会导致受体降解，但研究人员发现，LAG3 泛素化并不影响其在 T 细胞中的表达水平和蛋白半衰期。MS 分析显示 LAG3 存在 K48、K63 和非经典 K11 连接的泛素链，进一步研究表明 LAG3 主要发生非 K48 连接的泛素化。而且，relatlimab 阻断 LAG3 与配体结合后，可完全抑制 LAG3 泛素化，同时逆转 LAG3 对 IL - 2 产生的抑制作用。此外，不能发生泛素化的 LAG3 突变体，其抑制功能显著丧失，这表明泛素化正向调节 LAG3 的抑制功能。

4. Cbl 家族连接酶介导 LAG3 泛素化：为了探究参与 LAG3 泛素化的 E3 连接酶，研究人员采用 TurboID 标记技术，发现 c - Cbl 和 Cbl - b 在激活的样本中被 LAG3 - TurboID 特异性标记。通过基因敲除实验，证实 c - Cbl 和 Cbl - b 在介导 LAG3 泛素化中具有冗余功能，两者双敲除可完全消除 LAG3 泛素化，而单独敲除其中一个则不能。同时，在细胞系和原代 T 细胞中，过表达 c - Cbl 或 Cbl - b 可恢复 LAG3 泛素化，使用 Cbl 小分子抑制剂也能显著抑制 LAG3 泛素化。此外，Cbl 家族连接酶对 LAG3 的抑制功能至关重要，双敲除 Cbl 家族连接酶可消除 LAG3 的抑制功能，而过表达 c - Cbl 或 Cbl - b 可恢复其功能。

5. 泛素化阻碍 LAG3 胞质尾部与细胞膜的相互作用：研究人员发现 LAG3 近膜区域存在一个富含碱性残基的序列（BRS）基序，它与膜酸性磷脂相互作用，可将 LAG3 的关键信号元件 FSALE 基序隔离在细胞膜内，使其无法启动 LAG3 信号传导。通过芳香族荧光发射（AFE）、荧光共振能量转移（FRET）和 NMR 等实验，证实了 LAG3 - NCR 和 LAG3 - FL 能与模拟细胞膜的 PMLC 结合，且 FSALE 基序插入到膜双层的疏水内部。而 LAG3 泛素化可有效破坏这种相互作用，使 FSALE 基序暴露，从而激活 LAG3 信号传导。此外，构建的 LAG3^10AA突变体通过空间分离阻碍 BRS - FSALE 与膜结合，其抑制功能显著增强，进一步证明了泛素化通过阻碍膜结合来调节 LAG3 功能。

6. LAG3 泛素化对 LAG3 介导的抗肿瘤免疫抑制至关重要：研究人员通过研究 LAG3^KR小鼠（LAG3 泛素化缺陷）的 T 细胞功能，发现其在体外对 T 细胞激活和功能的抑制作用受损，产生的细胞因子增多，T 细胞增殖抑制能力下降。在体内实验中，接种 MC38 小鼠结肠癌和 B16 黑色素瘤细胞后，LAG3^KR小鼠的肿瘤生长明显减缓，生存率提高，肿瘤浸润 T 细胞比例增加，这表明 LAG3 泛素化在体内对 LAG3 介导的抗肿瘤免疫抑制起着关键作用。

7. LAG3 泛素化作为癌症免疫治疗的潜在生物标志物：研究人员检测了七种已在临床试验中测试的 LAG3 阻断抗体，发现它们均能显著抑制 LAG3 泛素化，且抗体增强 IL - 2 产生的能力与抑制 LAG3 泛素化的能力呈正相关。通过构建人源化 LAG3 敲入小鼠模型和高灵敏度的靶向 MS 方法，证实了 LAG3 泛素化在肿瘤微环境中确实存在，且可被 FDA 批准的治疗性 LAG3 阻断剂有效抑制。此外，分析黑色素瘤临床试验数据发现，LAG3 和 Cbl 家族连接酶的共表达与患者的临床结果相关，高表达 LAG3/Cbl 的患者 T 细胞耗竭增强，抗肿瘤免疫受损，生存率降低，但对 LAG3 阻断治疗的反应更好，这表明 LAG3/Cbl 共表达可作为预测 LAG3 阻断治疗反应的生物标志物。

在研究结论和讨论部分，该研究揭示了 LAG3 激活的新机制，即配体诱导的非 K48 连接的泛素化通过阻碍膜结合释放 FSALE 基序，从而激活 LAG3 的抑制功能。这一发现为理解 LAG3 - 基于检查点治疗的机制提供了新的视角，也为开发更有效的联合免疫疗法提供了有价值的方向。然而，目前研究存在一定的局限性，如临床队列样本量有限且仅涉及单一癌症类型，未来需要更多不同肿瘤类型的大规模研究来进一步验证。总的来说，这项研究在 LAG3 免疫检查点领域取得了重要突破，为癌症免疫治疗的发展奠定了坚实基础，有望推动相关领域的进一步发展，为更多癌症患者带来新的希望。