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为检测 Bopivirus B 并调查其感染情况，研究人员建立 TaqMan qPCR 方法，发现其流行广泛且与腹泻有关。
在动物健康领域，病毒的肆虐常常让养殖从业者们头疼不已。近年来，一种名为 B 型博尔纳病毒（Bopivirus B）的新型病毒逐渐进入人们的视野，它属于微小核糖核酸病毒科（Picornaviridae），主要影响山羊和绵羊。自 2021 年在匈牙利首次从山羊和绵羊腹泻粪便样本中被发现后，中国四川也检测到了它的踪迹。然而，由于缺乏有效的细胞培养系统来分离该病毒，并且流行病学数据有限，Bopivirus B 对山羊的致病潜力一直模糊不清。传统的逆转录聚合酶链反应（RT-PCR）方法存在耗时久、劳动强度大、无法高通量检测和定量分析病毒等缺点，严重制约了对 Bopivirus B 的研究。为了突破这些困境，西南民族大学的研究人员开展了一项重要研究，相关成果发表在《Acta Veterinaria Scandinavica》上。
研究人员采用了多种关键技术方法。首先是样本采集，他们收集了来自四川 6 个不同农场的 257 份山羊粪便样本，包括 86 份腹泻样本和 171 份非腹泻样本，这些样本的山羊年龄在 2 天到 3 个月之间。接着进行核酸提取，将粪便样本按 1:5 比例悬浮在磷酸盐缓冲液（PBS）中，经过离心、过滤后，分别提取病毒 RNA 和 DNA。然后利用 Beacon Designer 8 软件设计针对 Bopivirus B 3D 基因的引物和探针，建立 TaqMan 实时荧光定量 PCR（TaqMan qPCR）方法。同时，设计三对引物用于扩增 Bopivirus B 完整 3D 基因，对 PCR 产物进行克隆测序，进而进行基因序列分析。
研究结果如下：
- TaqMan qPCR 的性能：优化反应条件后，该方法在 2.73×103 - 2.73×10? copies/μL 范围内呈现良好的线性关系，相关系数 R2 = 0.999，扩增效率达 109%。特异性实验表明，它仅对 Bopivirus B 样本有阳性荧光扩增信号，对其他 16 种与山羊腹泻相关的病原体无扩增信号。灵敏度测试显示其检测限为 27.3 copies/μL，且重复性良好，批内变异系数在 0.90 - 1.75% 之间，批间变异系数在 0.63 - 2.44% 之间。与传统 RT-PCR 方法相比，TaqMan qPCR 的检测率更高，达 36.05%，而 RT-PCR 仅为 12.79%。
- Bopivirus B 在山羊中的感染情况：通过 TaqMan qPCR 检测 257 份粪便样本，发现 Bopivirus B 的总体阳性率为 19.46%，腹泻样本中的阳性率（33.72%）显著高于非腹泻样本（12.28%），且各农场腹泻样本的阳性率均高于健康样本，这强烈暗示 Bopivirus B 与山羊腹泻存在潜在关联，同时也表明该病毒在四川山羊中广泛流行。
- 3D 基因的分子特征：研究人员成功从 5 个农场的 10 份阳性样本中克隆出完整的 3D 基因，其长度为 1494bp，编码 497 个氨基酸残基。这些基因序列相似度高，与 GenBank 中已有的 4 个完整 Bopivirus B 3D 基因序列有较高的核苷酸和氨基酸同一性。系统发育分析发现，7 个 Bopivirus B 菌株与实验室之前提交的山羊源 Bopivirus B 菌株 SWUN/B1/2022 的 3D 基因关系密切，另外 3 个 3D 基因与中国绵羊源 Bopivirus 菌株 65 - k141 聚类，且这 10 个菌株与已有序列相比存在 21 个独特的氨基酸替换。
研究结论和讨论部分指出，此次研究成功建立了以 3D 基因作为靶标的 TaqMan 实时荧光定量 PCR 检测方法，该方法特异性强、重复性好、灵敏度高，为 Bopivirus B 的检测、流行病学调查和定量分析提供了有力工具。研究揭示了 Bopivirus B 在中国山羊中广泛流行，并且发现其与山羊腹泻存在关联。然而，Bopivirus B 对动物的致病潜力仍不明确，后续需要进一步扩大样本收集范围，深入研究其在中国的流行情况以及对反刍动物的致病性。同时，3D 基因上独特的氨基酸突变对其功能的影响也有待进一步探究。这些研究对于保障畜牧业健康发展具有重要意义，持续的监测、全面的分子特征分析和流行病学调查将助力人们更好地了解 Bopivirus B 及其对动物健康的影响。
