Caveolin-1 酪氨酸14磷酸化调控细胞外囊泡促进黑色素瘤转移新机制

为探究 Caveolin-1（CAV1） Y14磷酸化对细胞外囊泡（EVs）影响，研究发现其促进 EVs 中相关蛋白转移，影响黑色素瘤转移

　　在生命的长河中，癌症始终是威胁人类健康的 “恶魔”，它如同隐藏在暗处的杀手，无情地夺走无数生命。据统计，癌症是全球非传染性疾病死亡的第二大原因，每年约有 1000 万人因它离世，同时新增 1930 万病例 。其中，黑色素瘤作为一种常见的癌症，近年来发病率显著上升。它就像一颗 “定时炸弹”，早期就容易发生转移，而且对化疗药物的耐药性不断增强，使得患者的死亡率居高不下。肿瘤细胞要实现转移，需要获得一系列特殊能力，如更强的黏附、迁移和侵袭能力，这些能力就像 “钥匙”，帮助肿瘤细胞突破重重防线，实现转移。而 Caveolin-1（CAV1，一种膜蛋白和支架蛋白）在这一过程中扮演着重要角色。已有研究表明，CAV1 在黑色素瘤、乳腺癌等多种癌症患者体内表达上调，它可以通过激活 CAV1-Rab5-Rac1 信号轴，促进肿瘤细胞的迁移和侵袭。更重要的是，CAV1 酪氨酸¹⁴（Y¹⁴）的磷酸化与肿瘤细胞的迁移和转移密切相关。然而，CAV1 究竟是如何在细胞内（内在机制）和细胞间（外在机制）促进肿瘤转移的，尤其是在细胞外囊泡（Extracellular Vesicles，EVs）介导的细胞间通讯中，CAV1 Y¹⁴磷酸化的作用还不清楚。这就像在黑暗中摸索，急需一道光来照亮前行的道路。为了揭开这些谜团，来自智利大学等多个研究机构的研究人员展开了深入研究。他们的研究成果发表在《Cell Communication and Signaling》杂志上，为我们理解黑色素瘤的转移机制提供了新的视角。

研究人员主要运用了以下几种关键技术方法：一是细胞培养与转染技术，将不同形式的 CAV1（野生型、Y¹⁴E 突变体、Y¹⁴F 突变体）转染到 B16F10 小鼠黑色素瘤细胞中；二是 EVs 的分离与鉴定技术，通过超速离心法从细胞培养上清中分离 EVs，并利用纳米颗粒跟踪分析、透射电子显微镜和蛋白质免疫印迹等方法对其进行鉴定；三是蛋白质组学分析技术，对 EVs 中的蛋白质进行质谱分析，以确定其蛋白质组成和功能；四是细胞功能实验，包括细胞迁移、侵袭和转移实验，评估 EVs 对受体细胞生物学行为的影响；五是动物实验，将处理后的 B16F10 细胞注射到 C57BL/6 小鼠体内，观察肿瘤的转移情况。

下面来看看具体的研究结果：

1. CAV1 Y¹⁴磷酸化不影响 EVs 的释放、大小和形态：研究人员构建了稳定转染不同形式 CAV1 的 B16F10 细胞系，包括空质粒转染的 B16F10 (Mock)、野生型 CAV1 转染的 B16F10 (CAV1)、Y¹⁴E 突变体转染的 B16F10 (CAV1/Y¹⁴E) 和 Y¹⁴F 突变体转染的 B16F10 (CAV1/Y¹⁴F)。通过纳米颗粒跟踪分析和透射电子显微镜观察发现，不同细胞系释放的 EVs 在大小（直径 90 - 300nm，约 80% 小于 200nm）、浓度和形态上没有明显差异。蛋白质免疫印迹结果显示，所有 EVs 都含有常见的 EV 标记蛋白，如 ALIX、TSG101 和 CD81，且不含有 β - 肌动蛋白，表明 EVs 的纯度较高。同时，在表达 CAV1 的细胞系来源的 EVs 中检测到 CAV1，但 CAV1 (Y¹⁴F) 突变体来源的 EVs 中 CAV1 水平比 CAV1 (Y¹⁴E) 或野生型 CAV1 来源的 EVs 低约 50%。
2. B16F10 (CAV1) 和 (CAV1/Y¹⁴E) 来源的 EVs 促进 B16F10 (Mock) 细胞的迁移和侵袭：将不同来源的 EVs 与 B16F10 (Mock) 细胞共孵育 24 小时后，进行细胞迁移和侵袭实验。结果表明，B16F10 (CAV1) 和 (CAV1/Y¹⁴E) 来源的 EVs 能够显著促进受体细胞的 3D 迁移和侵袭，相比之下，B16F10 (Mock) 和 (CAV1/Y¹⁴F) 来源的 EVs 则没有明显作用。而且，不同 EVs 的摄取效率没有显著差异，说明上述差异不是由 EVs 摄取不同导致的。
3. B16F10 (CAV1) 和 (CAV1/Y¹⁴E) 来源的 EVs 中蛋白质与细胞黏附和迁移信号通路相关：通过蛋白质组学分析，研究人员在不同 EVs 中鉴定出了多种蛋白质。基因本体富集分析显示，CAV1 和 CAV1 (Y¹⁴E) 来源的 EVs 中，参与细胞迁移和黏附生物学过程的蛋白质丰度普遍高于 Mock 和 CAV1 (Y¹⁴F) 来源的 EVs。
4. β₃整合素通过摄取 B16F10 (CAV1/Y¹⁴E) 来源的 EVs 转移到 B16F10 Mock 细胞中：在黑色素瘤的发展过程中，β₁和 β₃整合素的上调与转移密切相关，尤其是 β₃整合素表达的黑色素瘤更容易转移到肺部。蛋白质组学分析发现，CAV1 和 CAV1 (Y¹⁴E) 来源的 EVs 中，一些整合素，特别是 α_V和 β₃整合素显著富集。进一步实验证实，B16F10 (CAV1/Y¹⁴E) 来源的 EVs 能够将 β₃整合素转移到 B16F10 (Mock) 细胞中，导致受体细胞表面 β₃整合素表达增加。
5. B16F10(CAV1/Y¹⁴E) 来源的 EVs 促进转移，且该过程可被抗 α_Vβ₃整合素抗体阻断：在体内转移实验中，将预处理的 B16F10 (Mock) 细胞注射到 C57BL/6 小鼠体内，结果显示，B16F10 (CAV1) 和 (CAV1/Y¹⁴E) 来源的 EVs 能够显著增加小鼠肺部肿瘤的重量，而 B16F10 (CAV1/Y¹⁴F) 来源的 EVs 则没有明显作用。预先用抗 α_Vβ₃整合素抗体处理 CAV1/Y¹⁴E 来源的 EVs，能够完全阻断其促进肺部转移的能力，而抗 β₁整合素抗体只能部分抑制该过程。

研究结论和讨论部分指出，CAV1 Y¹⁴磷酸化不仅在癌细胞内促进迁移、侵袭和转移，还影响 CAV1 和特定货物蛋白在 EVs 中的装载。来自过表达野生型和磷酸模拟型 CAV1 的癌细胞的 EVs 含有与黏附、迁移、侵袭和转移相关的蛋白质，如 β₃整合素。阻断 α_Vβ₃整合素可以降低受体细胞的转移潜能，这表明这些蛋白质在 CAV1 表达的黑色素瘤细胞来源的 EVs 赋予的侵袭性中起着重要作用。阻断 EVs 中的整合素功能可能是限制癌症进展的重要靶点，因为它可以破坏 EVs 在促进转移、肿瘤 - 基质通讯和细胞外基质重塑中的作用，减少癌细胞的侵袭，抑制转移前微环境的形成，并有可能克服治疗耐药性。此外，研究人员还推测，用 src 家族激酶抑制剂处理 CAV1 表达的细胞，可能不仅减少相同细胞的转移，还可能阻止促进转移的 EVs 的产生，为癌症治疗提供了新的思路和潜在的治疗策略。这项研究为理解黑色素瘤的转移机制提供了重要的理论依据，也为开发新的癌症治疗方法指明了方向，就像在黑暗中为癌症研究点亮了一盏明灯，让我们在攻克癌症的道路上又前进了一步。