新型镰刀形镰刀菌 AUMC 16563 来源的 L - 天冬酰胺酶：从优化生产到抗癌潜力的深度挖掘

为解决现有 L - 天冬酰胺酶（L-asparaginase）问题，研究人员从镰刀形镰刀菌 AUMC 16563 提取该酶，发现其有抗癌活性，意义重大。

　　在生命科学与医学的广阔领域中，有一种名为 L - 天冬酰胺酶（L-asparaginase，简称 L-ASNase）的神奇酶，它在抗癌战场上扮演着关键角色。L - 天冬酰胺酶能够催化 L - 天冬酰胺水解，释放出氨和 L - 天冬氨酸。肿瘤细胞由于缺乏天冬酰胺合成酶，无法自行合成 L - 天冬酰胺，只能依赖于细胞外的 L - 天冬酰胺来进行蛋白质合成。而 L - 天冬酰胺酶就像一位 “精准刺客”，能够降低血液中 L - 天冬酰胺的浓度，让肿瘤细胞因 “营养匮乏” 而无法增殖，从而达到抑制肿瘤生长的目的。

近三十年来，L - 天冬酰胺酶作为治疗急性淋巴细胞白血病（ALL）的化疗药物，在联合化疗方案中发挥着至关重要的作用。不仅如此，它在黑色素肉瘤、网状组织细胞增多症、淋巴细胞白血病等多种癌症的治疗中也展现出了良好的效果，并且在制药和生物标志物行业也有重要应用。然而，目前临床使用的 L - 天冬酰胺酶主要来源于细菌，这带来了一系列问题。例如，细菌来源的 L - 天冬酰胺酶容易引发过敏反应，而且其产量难以满足临床需求。此外，一些来源于大肠杆菌和菊欧文氏菌的 L - 天冬酰胺酶还存在超敏反应、抗原性、半衰期短、血液清除快以及 L - 谷氨酰胺酶依赖性神经毒性等问题。因此，寻找新的微生物来源的 L - 天冬酰胺酶，成为了科研人员亟待攻克的难题。

为了解决这些问题，来自埃及多个研究机构（包括 Assiut 大学的多个学院和研究中心等）的研究人员展开了深入研究。他们将目光聚焦在一种名为镰刀形镰刀菌（Fusarium falciforme）AUMC 16563 的真菌上，旨在从这种真菌中提取 L - 天冬酰胺酶，并对其进行全面的研究和评估，探索其作为新型抗癌酶的潜力。这项研究成果发表在《BMC Microbiology》杂志上。

在研究过程中，研究人员主要运用了以下几种关键技术方法：首先是分子鉴定技术，通过提取镰刀形镰刀菌 AUMC 16563 的 DNA，利用 PCR 扩增和测序技术，对该菌株进行分子水平的鉴定；其次是蛋白质纯化技术，采用硫酸铵沉淀、透析以及 DEAE - 纤维素离子交换柱和 Sephacryl S 200 HR 凝胶过滤柱等方法对 L - 天冬酰胺酶进行纯化；还有酶活性测定技术，运用 Nesslerization 方法测定酶活性，通过检测反应释放的氨来确定酶的活性单位；此外，利用 MTT 法检测酶对多种癌细胞系的细胞毒性，通过 DNA 凝胶电泳和基因表达分析等技术探究酶诱导癌细胞凋亡的机制。

研究结果如下：

• 分子鉴定：经鉴定，该菌株为镰刀形镰刀菌。研究人员通过对其内部转录间隔区（ITS）序列进行分析，构建了系统发育树，确定了其在镰刀菌属中的分类地位。
• 发酵参数优化：研究发现，当培养基 pH 为 8.0，以 0.2% 葡萄糖和 1.0% 天冬酰胺为碳氮源，在 25°C 条件下培养 5 天时，镰刀形镰刀菌 AUMC 16563 产生的 L - 天冬酰胺酶活性最高，可达 123.42 U/mL 。在众多氮源中，酵母提取物是最有效的氮源，能使酶活性达到 119.92 ± 7.2 U/mL ，但总体而言，添加其他氮源会降低酶活性。
• 酶的纯化与特性：经过 DEAE - 纤维素和 Sephacryl S 200 HR 两步柱层析纯化，L - 天冬酰胺酶的比活性提高了 14.26 倍，达到 5109.4 U/mg，蛋白质浓度为 2.38%。SDS-PAGE 分析显示，该酶的分子量为 46.06 kDa。该酶在 pH 9.0、39°C 时活性最高，为 5383.37 ± 310 U/mg 。金属离子对酶活性影响显著，K+ 、Na+ 、Ca2+ 和Fe2+ 等对酶有激活作用，而Mg2+ 、Co2+ 、Mn2+ 、Cu2+ 、Zn2+ 等会抑制酶活性，金属螯合剂 EDTA 对酶活性无影响。以 L - 天冬酰胺为底物时，该酶的Km? 值为5.77×10?2mM ，Vmax? 值为 128.22 μmol/min，表明其对 L - 天冬酰胺具有较高的亲和力。
• 体外抗癌活性：研究人员使用 MTT 法检测了 L - 天冬酰胺酶对 PC-3（前列腺癌细胞系）、HePG-2（人肝癌细胞系）、HCT-116（结肠癌细胞系）和 MCF-7（乳腺癌细胞系）的细胞毒性。结果显示，随着酶浓度的增加，细胞活力逐渐降低。该酶对不同细胞系的IC50? 值分别为：PC-3 细胞 78.6 μg/mL，HePG-2 细胞 69.6 μg/mL，HCT-116 细胞 51.5 μg/mL，MCF-7 细胞 32.8 μg/mL，表明其对 MCF-7 细胞的抑制作用最强。通过基因表达分析发现，在 MCF-7 细胞中，经 L - 天冬酰胺酶处理后，促凋亡基因 BAX 和 p53 的表达显著增加，抗凋亡基因 BCL-2 的表达显著降低。同时，DNA 凝胶电泳和 Diphenylamine 反应结果显示，处理后的 MCF-7 细胞 DNA 碎片化程度明显增加，这进一步证明了 L - 天冬酰胺酶能够诱导癌细胞凋亡。
• 体内毒性研究：在动物实验中，给小鼠注射镰刀形镰刀菌 AUMC 16563 产生的 L - 天冬酰胺酶后，生化指标显示，该酶对小鼠的血糖、其他电解质、肝功能和肾功能影响较小，虽然总胆红素水平、天冬氨酸转氨酶（AST）和丙氨酸转氨酶（ALT）活性略有升高，但表明其对肝脏功能影响轻微。实验过程中，所有血液学参数均在正常范围内，小鼠在实验期间全部存活。

综上所述，研究人员成功从镰刀形镰刀菌 AUMC 16563 中提取并纯化了 L - 天冬酰胺酶，对其发酵条件进行了优化，明确了其酶学特性和抗癌活性。该研究不仅为 L - 天冬酰胺酶提供了新的微生物来源，而且为癌症治疗提供了一种潜在的新型药物。虽然该酶在体内对肝脏功能有轻微影响，但总体安全性良好，具有进一步开发和应用的潜力。这一研究成果为抗癌药物的研发开辟了新的方向，有望在未来的临床治疗中发挥重要作用，为癌症患者带来新的希望。