人类冠状病毒（Human coronavirus，HCoV）的核衣壳（Nucleocapsid，N）蛋白在病毒的生命周期中意义重大，它参与病毒基因组的包装、转录以及免疫调节等多个关键环节。其中，SARS-CoV-2 的 N 蛋白更是备受关注，它不仅在被感染细胞以及相邻未感染细胞的表面大量表达，还能与 11 种人类趋化因子高亲和力结合，抑制体外白细胞的趋化作用，从而阻碍免疫系统对病毒的有效防御。但 N 蛋白与趋化因子之间究竟是如何相互作用的，这一问题一直悬而未决，也成为了研发抗病毒疗法的关键阻碍。
为了解开这一谜团，美国国立卫生研究院（NIH）国家过敏和传染病研究所（NIAID）病毒疾病实验室细胞生物学部门的研究人员 Alberto Domingo López-Mu?oz 和 Jonathan W. Yewdell 展开了深入研究。他们的研究成果发表在《Virology Journal》上，为我们理解 SARS-CoV-2 的免疫逃逸机制以及开发潜在的抗病毒药物提供了重要线索。
研究人员在此次研究中，主要运用了生物层干涉技术（Bio-layer interferometry，BLI）。该技术就像是一个微观世界的 “观察哨”，能够实时监测生物分子之间的相互作用。研究人员利用它来精确测定 SARS-CoV-2 的 N 蛋白与趋化因子之间的结合情况。同时，研究中涉及的细胞实验主要基于人胚肾 293FT（HEK293-FT）细胞系展开，通过对这些细胞进行转染等操作，获取含有目标蛋白的细胞裂解物用于后续实验。
SARS-CoV-2 N 蛋白利用 RNA 结合和二聚化结构域结合趋化因子
研究人员选取了 CCL26、CCL28 和 CXCL10 这 3 种趋化因子，采用基于生物层干涉技术的抗体竞争试验，来探究它们与 N 蛋白的 N 端结构域（N-terminal domain，NTD）和 C 端结构域（C-terminal domain，CTD）的结合情况。在实验中，研究人员先将带有两个链霉亲和素结合肽（StrepTag）的重组 N 蛋白（N-2xStrep）固定在链霉亲和素（streptavidin，SA）衍生的生物传感器上，接着让其与针对 NTD 或 CTD 的单克隆抗体（mAb）饱和结合，随后再加入选定的趋化因子。通过生物层干涉技术监测趋化因子与 N 蛋白结合和解离的过程，以未与单克隆抗体预孵育时趋化因子与 N 蛋白的结合反应作为 100% 结合值进行对比。
实验结果显示，根据单克隆抗体和趋化因子组合的不同，趋化因子与 N 蛋白的结合竞争率在 25% - 75% 之间。这表明，每种被测试的趋化因子都能与 N 蛋白的 NTD 和 CTD 结合。为了进一步验证这一结论，研究人员挑选了两种单克隆抗体（Ab 2，针对 NTD；Ab 6，针对 CTD），这两种抗体单独使用时，均可使 N 蛋白的趋化因子结合反应降低约 50%。当同时使用这两种抗体阻断 NTD 和 CTD 时，CCL26、CCL28 和 CXCL10 与 N 蛋白的结合被完全消除。这一系列实验充分证明，N 蛋白的 RNA 结合结构域（NTD）和二聚化结构域（CTD）都能独立地与趋化因子结合。
SARS-CoV-2 N 蛋白通过趋化因子的 GAG 结合位点与之结合
趋化因子具有独立的 GAG 结合位点和受体结合位点。为了确定这些位点在与 N 蛋白结合过程中的作用，研究人员开展了 GAG 竞争试验。他们选择了硫酸软骨素（chondroitin sulfate，CS），一种之前研究表明不会与 N 蛋白发生明显结合的可溶性 GAG。在实验中，研究人员将 CCL26、CCL28 和 CXCL10 这几种趋化因子分别与 CS 预孵育，然后观察其对趋化因子与固定在生物传感器上的 N 蛋白结合的影响。结果发现，CS 能够以剂量依赖的方式阻断趋化因子与 N 蛋白的结合，这意味着趋化因子主要通过其 GAG 结合位点与 N 蛋白相互作用。
综合以上研究结果，趋化因子通过其 GAG 结合位点，分别与 SARS-CoV-2 N 蛋白的 RNA 结合结构域和二聚化结构域独立相互作用。而且，N 蛋白与趋化因子的结合亲和力（纳摩尔级别）远高于与单链 RNA（ssRNA，微摩尔级别）的结合亲和力。此前研究分析 N 蛋白与 11 种趋化因子结合的生物层干涉动力学数据时发现，其结合模式呈现出异质性，并不符合经典的 1:1 相互作用模式，而本研究进一步证实，基于趋化因子在 N 蛋白两个独立位点结合的 2:1 异质配体模型，是计算亲和力常数的最佳模型。
此次研究首次明确了 SARS-CoV-2 N 蛋白与趋化因子的结合机制，即 N 蛋白的 RNA 结合和二聚化结构域均可与趋化因子结合，且结合是通过趋化因子的 GAG 结合位点实现的。这一发现意义非凡，它为开发能够阻断这种相互作用的化合物提供了理论依据，有望成为潜在的抗冠状病毒治疗方法。同时，研究结果也为后续进一步研究 SARS-CoV-2 的免疫逃逸机制以及不同冠状病毒 N 蛋白与趋化因子结合的结构基础差异等问题，指明了方向。虽然目前针对病毒与免疫系统相互作用的研究仍有许多未知领域，但此次研究成果无疑为我们在这场与病毒的斗争中，提供了新的有力武器，让我们离战胜病毒又近了一步。
