基于氨盐缓冲体系的酶联质谱分析法用于 DNA 超灵敏检测

《Analytical Biochemistry》：Ammonium bicarbonate buffer system for DNA hybridization and quantification by LC-ESI-MS/MS

来自加拿大的研究人员为解决 DNA 检测难题，开展氨盐替代 NaCl 的研究，实现飞摩尔至皮摩尔级检测。

　　在液体活检或其他有限样本中，对特定 DNA 序列进行高质量定量分析的需求十分迫切。DNA 杂交阵列是常用的监测基因表达的系统，通常采用荧光检测，但荧光检测存在信号响应非线性、校准稳定性差等问题，且荧光标签灵敏度不及酶联检测系统。酶联检测虽能放大信号，但固相检测中亲和试剂或酶与固相表面的非特异性结合会限制其灵敏度。质谱检测具有高选择性和灵敏度，但 DNA 杂交所需的高浓度盐（如 1 - 2M NaCl）与质谱不兼容。

研究人员对氨盐（如碳酸氢铵 AMBIC 或乙醇胺）中的 DNA 杂交条件进行优化，并通过液相色谱 - 电喷雾串联质谱 (LC - ESI - MS/MS) 对 HIV DNA 进行线性和高斯检测。研究发现，在高盐浓度下，基于碱性磷酸酶 - 链霉亲和素（APSA）酶结合物与底物 BCIP/NBT 反应的比色 DNA 杂交检测，对 HIV DNA 的线性检测范围为 1pM 至 100pM。而 AMBIC 或乙醇胺能实现与 NaCl 相似的强 DNA 杂交效果，且与质谱兼容。

APSA 将底物 AMP 转化为腺苷，通过监测质荷比（m/z）268 的前体离子，并绘制 m/z 136（m/z 268→m/z 136）的碎片离子强度，经对数转换后，在皮摩尔范围内，对 HIV DNA 的线性和高斯分析误差可达 10%，在低至 100fM 时仍呈线性关系。

酶联质谱分析法 (ELiMSA) 仅需 0.1μL（100nL）样本反应液进样，就能在飞摩尔至皮摩尔范围内直接分析目标 DNA。96 孔板比色检测对 1pM 的 DNA 敏感，但需 200μL 反应液获取光信号；ELiMSA 在高浓度范围的结果与比色法 BCIP/NBT 相似，而质谱检测在皮摩尔至飞摩尔范围内具有良好的信噪比，呈线性和高斯响应。

本研究旨在开发一种用铵盐替代 NaCl 的缓冲系统，使 96 孔板中的 DNA 杂交反应能直接用于液相色谱和串联质谱检测。高灵敏度的实现不仅依赖于降低背景、促进真实杂交，还与最强的酶促反应以及最特异灵敏的检测系统相关。该研究为 DNA 杂交检测提供了新的方法和思路。