新型无标记电化学适配体传感器用于睾酮检测的研究

《Analytical Biochemistry》：Electrochemical aptasensor for determination of testosterone using an aptamer-nanogold-metal-organic framework-ionic liquid modified carbon paste electrode

来自伊朗亚苏季大学的研究人员构建无标记电化学适配体传感器检测睾酮，结果良好，助力睾酮监测。

　　本研究聚焦于设计并构建一种选择性无标记电化学适配体传感器，用于检测实际样本中的睾酮（TST）。研究人员使用金纳米粒子（AuNPs）和金属有机框架 - 离子液体修饰的碳糊电极（AuNPs/Fe₃O₄–NH₂@Cu - ILCPE），来共价固定 TST 适配体（TST - apt）。AuNPs/Fe₃O₄–NH₂@Cu - ILCPE 展现出卓越的增强电化学峰电流的能力，这一特性可能源于电极表面的适配体。起初，研究人员探究并优化了信号与适配体浓度、适配体固定时间、AuNPs 电沉积时间以及适配体反应时间等变量之间的关系。在优化条件下，所提出的适配体传感器在 1.0 - 50.0 nM 和 50.1 - 1000.0 nM 范围内呈现两个线性范围，检测限为 0.31 nM，定量限为 0.99 nM。该适配体传感器还可用于检测尿液样本中的 TST，回收率在 97.2 - 103.8% 之间，令人满意。

激素在人体中有着特殊且不可忽视的作用，负责调节细胞分化、生长和繁殖等不同的细胞和生理功能。睾酮作为男性性激素，是人体主要的合成代谢类固醇和内源性雄激素。它在男性睾丸和女性卵巢中产生，对男性生殖组织的发育有着重要影响。此外，睾酮在维持骨骼健康、预防骨质疏松方面也发挥着关键作用，还受到运动员的青睐，因为它有助于增强力量。然而，睾酮也会带来一些副作用和健康问题，因此世界反兴奋剂机构禁止其违规使用。在制药科学中，睾酮应用广泛，男性尿液中通常含有 10^?8 mol/L 浓度的睾酮，激素治疗后其浓度会显著升高。但高浓度睾酮进入环境会引发诸多问题，因此它被视为对人类和野生动物均有害的有机微污染物。鉴于这种重要生物化合物的存在，以及其高浓度时的毒性和危险性，同时考虑到在复杂基质中尤其是低浓度下精确监测睾酮的需求，研究人员致力于设计并构建选择性好、灵敏度高的检测方法。此前，高效液相色谱 - 串联质谱（HPLC - MS/MS）、同位素稀释超高效液相色谱 - MS/MS、液相色谱 - 质谱联用（LC - MS）以及气相色谱 - 质谱联用等多种检测平台已被用于睾酮监测。尽管这些方法有效，但大多存在耗时、成本高、样品制备步骤繁琐、检测前需进行初步衍生化、萃取和 / 或纯化等局限性，严重限制了它们的应用。为解决这些问题，开发并应用替代方法成为研究热点。与基于色谱的技术不同，电化学方法具有快速、低成本、高灵敏度等优势。电化学生物传感器因其高灵敏度、快速响应、良好的选择性以及仪器小型化的潜力，被广泛用于睾酮监测。

适配体是人工合成的短链 DNA、RNA、XNA 或肽，能够与目标分子结合，因其相互作用能力被视为化学抗体。适配体具有高度特异性识别目标分子的能力，与其他生物识别元件相比，它还具有稳定性高、免疫原性低、易于人工合成、特异性更强、成本更低、可重复使用性更高以及化学修饰更灵活等特点。这些特性使适配体传感器成为传统抗体或酶基生物传感器的优秀替代品。由于适配体传感器操作简单、可小型化、成本相对较低、灵敏度高且响应迅速，因此是现场快速分析复杂基质中低含量目标化合物的理想工具。

信号放大可通过多种方法实现，比如应用具有较大表面积与体积比的纳米材料，它能加速传质过程。具有高稳定性、吸附能力、大表面积和大量结合位点的纳米材料是信号放大的关键部分。纳米材料独特的性质，尤其是将适配体固定在电极表面后，对电化适配体传感器的灵敏度、特异性和使用寿命有着显著影响。其中，金纳米粒子可用作生物分子的固定基质，提供较大的表面积，增强生物传感器的等离子体共振特性和电导率。

基于复合材料构建的生物传感器能显著改善适配体传感器的信号转导。近年来，基于配位聚合物的复合材料受到广泛关注和应用。金属有机框架（MOFs，即配位聚合物或配位网络）由金属离子和有机连接体反应生成，具有多孔晶体结构，比表面积大，可进行可逆电子交换，在构建生物传感器并用于电化学系统方面表现出色。离子液体（ILs）具有高热稳定性、高电导率等特性，作为导电粘合剂用于制备碳糊电极（CPEs），即碳离子液体电极（CILEs），能显著提高研究方法的性能指标，增强其在电化学过程中的适用性。碳离子液体电极结合了碳材料的优良导电性和稳定性以及离子液体独特的电化学性质，具有更优异的电化学性能、更宽的电化学窗口和更高的稳定性。其可调节的性质、环境友好性和高灵敏度使其在能量存储、电化学传感和电催化等领域具有广泛的应用前景。此外，碳离子液体电极制备简单，有望成为应对全球能源和环境挑战的一项有前途的技术。传统碳糊电极的制备方法是将碳颗粒与有机油混合，但有机油可能含有杂质和不需要的成分，会影响分析性能，而且有机油不导电，会降低分析方法的性能。这些问题促使研究人员寻找具有足够粘度的化学惰性液体替代有机油，以提高电化学电导率，进而提高灵敏度、增强抗污染性能、获得稳定的电化学响应和固有电催化活性，这种材料被认为可替代传统石蜡粘合剂。

在本研究中，研究人员首先合成了 Fe₃O₄–NH₂@Cu - BDC 纳米复合材料。这种基于 Fe₃O₄–NH₂@Cu 的金属有机框架纳米复合材料整合了磁性 Fe₃O₄纳米粒子、氨基功能化连接体和铜基金属有机框架，各组分在结构和功能上发挥独特作用。Fe₃O₄核心赋予材料磁性，便于分离和回收；NH₂基团增强了各组分之间的相互作用，提高了稳定性，并为金属离子提供额外的配位位点，从而提升催化活性。铜基金属有机框架具有多孔结构，有利于底物扩散和接触活性位点，铜中心的催化性能也为材料增色不少。这些组分相互协同，显著提高了催化性能。Fe₃O₄–NH₂@Cu 基金属有机框架纳米复合材料的创新之处在于其一体化设计，融合了磁性分离、增强稳定性和提高催化效率等优点，使其成为各种先进应用的理想材料。合成后，研究人员通过傅里叶变换红外光谱（FTIR）、X 射线衍射（XRD）和扫描电子显微镜（SEM）等多种分析方法对纳米复合材料进行了鉴定和表征。随后，研究人员首次使用碳糊制备了一种新型无标记电化学适配体传感器（BSA/aptamer/TGA/AuNPs/Fe₃O₄–NH₂@Cu - ILCPE），并将其用于睾酮检测。研究人员利用循环伏安法研究了适配体传感器的电化学行为，差分脉冲伏安法则用于对睾酮进行灵敏监测。该适配体传感器成功应用于尿液样本中睾酮的检测。

电化学测量使用 Autolab PGSTAT 302 N 电位计 / 恒电流仪（荷兰 Eco Chemie 公司）进行，伏安图则通过 EmStat DropSens 电位计 / 恒电流仪（西班牙阿斯图里亚斯技术公园 Drop Instrument 公司）记录，并与个人计算机连接进行数据采集和电位控制。实验采用三电极系统，包括一个玻璃电化学池，其中有 Ag/AgCl 参比电极、铂丝对电极。

对 Fe₃O₄–NH₂@Cu - BDC 纳米复合材料进行 FTIR 分析发现，在 558 cm^?1处出现对应 Fe₃O₄–NH₂中 Fe - O - Fe 振动的峰，3229 cm^?1处出现归属于 N - H 振动的峰，这表明成功制备了 Fe₃O₄–NH₂纳米粒子。457 cm^?1和 734 cm^?1处的峰分别可归因于 Cu - O 的伸缩和弯曲振动模式。1569 cm^?1、1398 cm^?1、1500 cm^?1和 734 cm^?1处新出现的吸收峰与对苯二甲酸中的 C=O、C - O、C=C 和 C - H 有关。

本研究基于 Fe₃O₄–NH₂@Cu - IL 和 AuNPs 修饰的碳糊电极，成功制备了一种新型无标记电化学适配体传感器。首先合成了 Fe₃O₄–NH₂@Cu 纳米复合材料，并使用 FT - IR、XRD 和 SEM 技术对其进行了表征。然后将 NH₂ - 适配体共价连接到纳米复合材料上，制备的适配体传感器用于检测尿液样本中的睾酮。由于适配体的特殊性质，该传感器提高了检测的选择性和稳定性。

Samira Nekooei 负责撰写初稿、验证、软件、方法、调查和形式分析。Mehrorang Ghaedi 负责撰写审核与编辑、监督、项目管理、方法、调查和数据整理。Mohammad Reza Baezzat 负责撰写审核与编辑、软件、方法、调查和形式分析。Javad Tashkhourian 负责撰写审核与编辑、验证、监督、方法和调查。Mika Sillanp?? 负责撰写审核与编辑、验证。

作者声明他们不存在已知的可能影响本文所报告研究工作的财务利益冲突或个人关系。

作者感谢伊朗亚苏季大学研究委员会提供的资金支持。