基于乳酸脱氢酶亚基抑制的肿瘤样本快速鉴别研究

《Analytica Chimica Acta》：Analytical approach to distinguishing lactate dehydrogenase fractions for oncological diagnostics

研究人员为解决癌症早期诊断问题，开展 LDH 亚基活性比例研究，可区分肿瘤和健康样本，意义重大。

　　在癌症的世界里，癌细胞就像一群疯狂生长的 “小怪兽”，它们有着极高的能量需求，为了满足这种需求，癌细胞的代谢方式发生了奇特的变化。正常细胞在有氧环境下，会通过复杂而高效的氧化磷酸化和三羧酸循环（Krebs cycle）产生 36 mol 的三磷酸腺苷（ATP），这就像是一辆节能高效的汽车，平稳地输出能量。但癌细胞却另辟蹊径，即便在氧气充足的情况下，它们也更倾向于进行无氧糖酵解（anaerobic glycolysis），虽然这种方式只能产生 2 mol 的 ATP，可胜在速度快，就像一辆小摩托车，虽然单次能量产出少，但能在短时间内快速运转，从而大量摄取葡萄糖。这一现象被称为 Warburg 效应，几乎在各种癌症中都能发现它的身影，比如胰腺癌、乳腺癌、肺癌和胶质母细胞瘤等。

而乳酸脱氢酶（Lactate dehydrogenase，LDH）在癌细胞的这种代谢转变中扮演着关键角色。LDH 是一种氧化还原酶，能够催化丙酮酸（pyruvate）和乳酸（lactate）之间的相互转化，同时涉及烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（NADH）和烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（NAD）的相互转换。它存在多种同工酶形式，其中由 M（肌肉型，LDHA）和 H（心脏型，LDHB）两种亚基组合而成的 LDH1 - LDH5 同工酶在临床上尤为重要。在正常人体组织中，这些同工酶有着特定的分布比例，但在癌症发生时，LDH 同工酶的比例会发生显著变化，富含 M 亚基的同工酶（LDH3、LDH4、LDH5）表达增加，这与癌细胞向无氧糖酵解的代谢重编程密切相关。

目前，癌症已成为全球第二大死因，在 2018 年就夺走了约 960 万人的生命。在癌症早期诊断中，能够快速、低成本地检测 LDH 同工酶的活性比例，对于发现潜在的癌症患者具有重要意义。然而，现有的检测方法存在各种问题。传统的分离方法，如电泳、离子交换色谱和亲和色谱等，虽然能够准确分离不同的 LDH 同工酶，但操作复杂、成本高；免疫化学方法（如 ELISA、western blotting）虽然特异性强，但价格昂贵；而基于同工酶催化特性和结构稳定性差异的动力学方法，虽然具有速度快、成本低和易于自动化等优点，但特异性相对较差。因此，开发一种更高效、准确且经济的检测方法迫在眉睫。

来自华沙医科大学（Medical University of Warsaw）和华沙玛丽亚?居里国家肿瘤研究中心（Maria Sk?odowska - Curie National Research Institute of Oncology）的研究人员，针对这一问题展开了深入研究。他们开发了一种基于多通流分析（Multicommutated Flow Analysis，MCFA）系统的新方法，通过基于 LDH 亚基抑制的动力学方法，快速、高效地区分肿瘤样本和健康样本。相关研究成果发表在《Analytica Chimica Acta》杂志上。

研究人员在实验过程中，主要运用了以下关键技术方法：首先，利用 MCFA 系统，精确控制溶液的剂量和反应时间。该系统由电磁阀泵和阀门组成，能够自动化地完成样本注入、混合酶底物、添加抑制剂和检测试剂等一系列操作。其次，采用分光光度法检测 LDH 活性，其原理是基于 NADH 在酶催化反应中产生的亚铁离子与 ferrozine 发生显色反应，通过检测亚铁离子的浓度来间接测定 LDH 的活性。最后，使用特定的抑制剂，如硫氰酸胍（guanidine thiocyanate）、尿素（urea）和高氯酸钠（sodium perchlorate），研究不同亚基组成的 LDH 同工酶活性受到的影响。

研究结果如下：

1. 抑制剂对 LDH 活性的影响：研究人员用不同浓度的硫氰酸胍、尿素和高氯酸钠处理从兔肌肉（富含 M 亚基，以 LDH5 为主）和牛心脏（富含 H 亚基，以 LDH1 为主）中分离的 LDH - M 和 LDH - H 组分。结果发现，这两种组分的活性对抑制剂浓度高度敏感。低浓度的高氯酸钠和硫氰酸胍会激活 H 亚基，而高浓度则会抑制；尿素在选定浓度范围内对 LDH - H 有激活作用。尽管酶的抑制和激活作用看似复杂，但混合的 LDH - M 和 LDH - H 在测试的抑制剂浓度范围内呈现出线性关系，这为后续实验提供了基础。
2. 分析方案的假设：基于癌细胞中富含 M 亚基的 LDH 同工酶增加的特点，研究人员通过混合富含 M 和 H 亚基的 LDH 组分，模拟不同的亚基比例变化，校准系统以追踪对特定抑制剂结合亲和力的变化。他们引入了一个描述 LDH - H 组分活性在总活性中百分比贡献的参数（ALDH - H），并发现 LDH - H 和 LDH - M 在无抑制情况下催化酶反应的活性相似，这使得通过校准曲线准确测定 ALDH - H 参数成为可能。
3. LDH 亚基比例估计：校准过程分为两步，首先测定总 LDH 活性，不同 ALDH - H 值下的吸光度差异不显著。然后在抑制剂存在的情况下进行酶反应，结果显示所有抑制剂的校准曲线在测试范围内均呈线性，决定系数均为 0.99。通过引入信号比（Signal ratio）参数，进一步确保了校准曲线不受总 LDH 活性微小波动的影响，尽管这会增加测量的不确定性。
4. 人血清样本分析：研究人员对健康患者和癌症患者的血清样本进行分析，先测定总 LDH 活性并稀释样本使其信号约为 100 U/L^?1，然后在抑制剂存在下测量酶活性，得到信号比及其不确定性。结果发现，除个别样本外，使用高氯酸钠和硫氰酸胍作为抑制剂时，癌症患者样本的 ALDH - H 参数低于健康患者样本，这表明该方法能够区分病理样本和健康样本，即使总 LDH 活性在参考范围内也能有效鉴别。而使用尿素作为抑制剂时，区分效果不理想。此外，该系统还能追踪患者治疗过程中 LDH 参数的变化，如通过对比患者不同时间的样本，发现总 LDH 活性增加、ALDH - H 参数降低，提示患者健康状况恶化。

研究结论和讨论部分指出，该研究证明了基于 MCFA 系统和 LDH 亚基抑制的分析方法在区分肿瘤样本和健康样本方面的有效性。使用高氯酸钠和硫氰酸胍作为抑制剂时，癌症患者样本的 ALDH 参数低于健康样本，这与癌细胞代谢变化导致富含 M 亚基的 LDH 同工酶合成增加的预期相符。然而，目前的研究只是概念验证，还需要在更大规模的临床样本中进行验证，以明确 ALDH 参数在医学诊断中的应用范围。与现有的 LDH 同工酶检测方法相比，该方法具有成本效益高、快速的优势，有望成为癌症筛查的新方法。但在实际应用前，还需要评估其潜在的危害，如过度诊断、过度治疗以及对患者的身心影响等，确保其益处大于危害。总之，这项研究为癌症早期诊断提供了新的思路和方法，具有重要的临床应用潜力。