VASP 基因敲低通过 cGMP-PKG 信号通路改善急性肺损伤：巨噬细胞极化的新突破

研究人员针对急性肺损伤（ALI）中 VASP 作用不明问题，研究发现 VASP 敲低可改善 ALI，意义重大。

　　急性肺损伤（Acute Lung Injury，ALI），就像是肺部健康的 “突然袭击者”。它来势汹汹，严重时甚至会发展成急性呼吸窘迫综合征（ARDS），对患者的生命健康构成极大威胁。尽管科研人员在 ALI 的研究道路上不断探索，取得了一些进展，但目前临床治疗手段主要还是以支持性治疗为主，ARDS 的发病率依旧居高不下。

在 ALI 的发病过程中，肺部的免疫细胞扮演着重要角色，其中肺泡巨噬细胞（Alveolar Macrophages，AMs）数量最多，它们的极化状态就像一个 “开关”，对肺部炎症的发展方向和进程有着重大影响。在 ALI 早期，AMs 会向促炎性的 M1 表型极化，释放如一氧化氮（NO）、白细胞介素（IL）-6 和肿瘤坏死因子（TNF）-α 等炎症介质，虽然这在宿主防御和炎症反应启动中发挥着关键作用，但过度激活却会导致组织损伤，让 ALI 病情雪上加霜。而在 ALI 的缓解阶段，AMs 则会转变为抗炎性的 M2 表型，分泌 IL-10 和 TGF-β 等介质，助力组织修复，恢复肺部的稳态。因此，M1 和 M2 巨噬细胞极化之间的动态平衡，就成为了决定 ALI 发展和转归的关键因素。

血管扩张刺激磷蛋白（Vasodilator-stimulated Phosphoprotein，VASP）作为细胞骨架动力学的重要调节因子，在细胞迁移、细胞骨架重塑以及炎症反应调节等过程中都发挥着重要作用。此前有研究表明，VASP 可能参与巨噬细胞极化的调节，在肝脏组织中还表现出抗炎特性。然而，在 ALI 发生时，VASP 在巨噬细胞极化过程中究竟扮演何种角色，目前还缺乏直接证据。为了揭开这个谜团，解放军总医院第六医学中心等机构的研究人员开展了一项深入研究，相关成果发表在《Inflammation》杂志上。

研究人员采用了多种关键技术方法。在动物实验方面，选用 C57BL/6 雄性小鼠构建脂多糖（Lipopolysaccharide，LPS）诱导的 ALI 小鼠模型，并通过气管内注射 VASP-AAV6 实现 VASP 基因在小鼠肺部的敲低。在细胞实验中，培养 MH-S 细胞，用 LPS 刺激诱导 M1 极化，同时转染 VASP shRNA 来下调 VASP 表达。此外，还运用了 RNA 测序技术筛选差异表达基因，利用 ELISA 测定炎症因子水平，通过蛋白质免疫印迹法（Western Blotting）检测蛋白表达，采用实时荧光定量聚合酶链反应（Real-Time Quantitative PCR，RT-qPCR）分析基因表达水平，借助免疫荧光测定观察蛋白表达定位，使用流式细胞术分析细胞表型等。

研究结果如下：

• VASP 在 LPS 诱导的 ALI 中表达上调：对 MH-S 细胞进行 RNA 测序，发现 LPS 刺激后有 1475 个差异表达基因，其中 VASP 表达显著增加。通过 Western Blotting 和 RT-qPCR 进一步验证，LPS 刺激 MH-S 细胞后，P-VASP 和 VASP 的表达水平明显上升，在 24 小时达到峰值。在 LPS 诱导的 ALI 小鼠模型中，肺组织 H&E 染色显示肺泡壁增厚、炎症细胞浸润，肺湿干重比、支气管肺泡灌洗液（BALF）中的蛋白含量以及 IL-6、IL-1β 和 TNF-α 水平均显著升高，同时免疫荧光染色表明 VASP 在 AMs 中的表达上调。
• VASP 敲低减轻 LPS 诱导的 ALI 小鼠肺损伤：构建靶向 VASP 的 AAV6-shRNA 载体并气管内注射到小鼠体内，成功敲低 VASP 表达。H&E 染色显示，VASP 敲低小鼠的肺组织病理明显改善，肺泡壁厚度和炎症细胞浸润减少。此外，肺损伤病理评分、肺湿干重比以及 BALF 中的蛋白含量和促炎细胞因子水平均显著降低。
• VASP 敲低抑制 LPS 诱导的 ALI 小鼠 AMs 的 M1 极化：对 ALI 小鼠 BALF 进行流式细胞术分析，发现 VASP 敲低显著降低了 CD86⁺CD206^-巨噬细胞的比例，同时增加了 CD206⁺CD86 巨噬细胞的比例。免疫荧光染色也证实，VASP 敲低减少了肺组织中 M1 巨噬细胞标记物 CD86 的表达，增加了 M2 巨噬细胞标记物 CD206 的表达。
• VASP 敲低抑制 LPS 诱导的 MH-S 巨噬细胞的 M1 极化：在体外建立巨噬细胞极化模型，用 LPS 处理 MH-S 细胞诱导 M1 极化，然后敲低 VASP 基因。结果显示，VASP 敲低显著降低了 CD86⁺CD206 巨噬细胞的比例，增加了 CD206⁺CD86 巨噬细胞的比例，同时降低了 M1 相关标记物（IL-1β 和 TNF-α）的表达水平和 NO 的释放，还减少了 M1 标记物的 mRNA 水平，增强了 M2 标记物的 mRNA 水平。
• VASP 是 cGMP-PKG 信号通路中促进巨噬细胞 M1 极化的关键介质：在 MH-S 细胞中，PKG 激动剂 8-Br-cGMP 可激活 VASP 在 Ser239 位点的磷酸化，而 PKG 抑制剂 KT5823 则抑制该磷酸化过程。研究还发现，8-Br-cGMP 增强了 LPS 诱导的 M1 巨噬细胞标记物的表达，KT5823 则降低了这些标记物的表达。此外，VASP 敲低或加入 KT5823 后，8-Br-cGMP 对 M1 标记物表达的影响不再显著，同时 M2 巨噬细胞标记物 Arg-1 的表达变化也进一步证实了 VASP 在 cGMP-PKG 信号通路调节巨噬细胞极化中的关键作用。

研究结论和讨论部分指出，该研究首次发现 VASP 在 ALI 小鼠的 AMs 中表达显著上调，特异性敲低 VASP 可减轻 LPS 诱导的炎症，抑制 M1 巨噬细胞极化，促进 M2 巨噬细胞极化，从而改善 ALI 症状。这一发现揭示了 cGMP-PKG 信号通路在调节肺部免疫细胞功能中的新作用，特别是通过 VASP 介导的 AMs 极化调节。不过，研究也存在一定局限性，如动物模型和细胞系与人类存在差异，研究中未涉及一些新兴的 M1/M2 极化标记物，以及 VASP 与其他信号通路的潜在相互作用尚未探索等。未来的研究可以进一步在人类来源的系统中验证这些发现，深入探究 VASP 的作用机制，评估其作为治疗 ALI 及相关炎症性疾病靶点的临床转化潜力。这一研究成果为深入理解 ALI 的发病机制和寻找新的治疗靶点提供了重要依据，有望为临床治疗带来新的思路和方法。