探究商用重组与传统 β- 葡萄糖醛酸苷酶，助力尿液药物筛查水解效率提升

为实现尿液药物代谢物快速分析，研究人员对比多种 β- 葡萄糖醛酸苷酶水解效率，确定适宜酶及条件。

　　在当今社会，药物滥用和误用问题日益严重，已然成为全球共同关注的焦点。从非法药物的泛滥，到非处方药物的过量服用，这些问题不仅危害个人健康，还引发了一系列社会难题。在医院的重症监护室中，常常难以判断患者所服用的药物；而在法医尸检场景下，确定死者生前摄入的药物更是难上加难。尿液，因其药物检测窗口期长、药物浓度相对较高，且采集方便无创，成为药物暴露分析的常用样本。然而，目前市面上简单的尿液药物检测试剂盒，只能检测部分受法律管制的药物，如兴奋剂、鸦片类和大麻等，越来越多的药物难以被检测出来。同时，药物进入人体后会发生代谢转化，最终以葡萄糖醛酸苷或硫酸盐结合物的形式经尿液排出。直接分析这些结合物困难重重，因此需要通过水解的方式将其转化为可检测的形式。基于这些问题，来自广岛大学（Hiroshima University）生物医学与健康科学研究生院法医学系和东海大学医学院急诊与重症医学系的研究人员 Akira Namera、Takeshi Saito 和 Masataka Nagao 开展了一项关于评估商用重组和传统 β- 葡萄糖醛酸苷酶（β-glucuronidases）水解效率的研究，相关成果发表在《Forensic Toxicology》上。

研究人员主要运用了液相色谱 - 串联质谱（LC-MS/MS）技术和酶水解实验两种关键技术方法。在酶水解实验中，他们选取了来自不同来源的两种市售 β- 葡萄糖醛酸苷酶和三种市售重组 β- 葡萄糖醛酸苷酶，以奥沙西泮 - o - 葡萄糖醛酸苷（oxazepam-o-glucuronide）、阿米替林 - N - 葡萄糖醛酸苷（amitriptyline-N-glucuronide）和苯海拉明 - N - 葡萄糖醛酸苷（diphenhydramine-N-glucuronide）为代谢物分析对象，在两种不同温度下进行水解反应，并监测反应进程。反应结束后，利用 LC-MS/MS 对水解产物进行定量分析。此外，实验中使用的认证无药人尿样本来自英国伦敦临床试验实验室服务中心（Clinical Trials Laboratory Services） 。

研究结果如下：

1. o - 葡萄糖醛酸苷的水解：所有酶在低温孵育下，都能在短时间内高效水解奥沙西泮 - o - 葡萄糖醛酸苷，且水解效率在 360 分钟内保持稳定。在高温孵育时，虽然也能快速水解，但大肠杆菌（E. coli）和 Fast β- 葡萄糖醛酸苷酶的水解效率会随反应时间下降。经研究发现，这是因为高温下奥沙西泮（oxazepam）不稳定，其含量会随孵育时间增加而减少。
2. N - 葡萄糖醛酸苷的水解：在低温孵育时，除了来自 H. pomatia 和 Fast β- 葡萄糖醛酸苷酶外，其他酶能在短时间内高效水解阿米替林 - N - 葡萄糖醛酸苷和苯海拉明 - N - 葡萄糖醛酸苷，且水解效率在 360 分钟内保持稳定。而 H. pomatia 和 Fast β- 葡萄糖醛酸苷酶在低温下的水解效率极低，反应 360 分钟都未能达到 20%。在高温孵育时，E. coli 和 IMCSzyme 3S 能在短时间内高效水解这两种 N - 葡萄糖醛酸苷。Fast β- 葡萄糖醛酸苷酶的水解效率随反应时间逐渐增加，60 分钟后达到 80%。H. pomatia 的水解效率虽有所增加，但 360 分钟后仍未达到 20%。同时，IMCSzyme 3S 水解阿米替林 - N - 葡萄糖醛酸苷时，水解效率会随反应时间逐渐下降，360 分钟后降至 50%，这是因为高温下阿米替林（amitriptyline）在缓冲液中不稳定。
3. 酶和缓冲液用量的影响：使用 IMCS RT 水解 N - 葡萄糖醛酸苷时，水解效率会因尿液批次不同而有所差异，但水解 o - 葡萄糖醛酸苷时不存在这种差异。增加酶和缓冲液的用量，N - 葡萄糖醛酸苷的水解效率会提高，而 o - 葡萄糖醛酸苷的水解效率会降低。综合考虑成本和水解效率，确定 IMCSzyme RT 水解时酶的添加量为 20μL。
4. 实际应用：将 IMCSzyme 3S 推荐的水解方法应用于疑似摄入苯二氮卓类药物或苯海拉明的法医尸检案例中。结果显示，水解后摄入苯二氮卓类药物的羟基化代谢物浓度比水解前更高，同时也能检测到苯海拉明，且其浓度高于母体药物。这表明该方法为实际法医案例中的药物筛查提供了一种快速、高效的途径。

在研究结论与讨论部分，研究人员指出，优化水解条件对于确保结合物完全解共轭至关重要。酶的用量、孵育温度、孵育时间和缓冲液的 pH 值等参数都会影响酶水解效果。不同来源和批次的酶，其选择性和反应性可能存在差异。重组酶具有质量稳定的优势，但存在有效期限制；E. coli 来源的酶可冷冻保存一年以上，但使用时需要准备酶溶液和缓冲液。本研究首次对 N - 葡萄糖醛酸苷结合物的水解效率进行了深入研究，为在短时间内分析结合物提供了可能。研究还发现，水解 o - 葡萄糖醛酸苷时，酶的特异性不明显，且多数酶可在短时间内完成水解，不受反应温度限制（Fast β- 葡萄糖醛酸苷酶除外）。对于 N - 葡萄糖醛酸苷的水解，不同酶表现出明显的底物特异性。综合各项研究结果，为实现人尿中药物代谢物的高通量分析，推荐使用 IMCSzyme 3S 或 E. coli 来源的 β- 葡萄糖醛酸苷酶。这一研究成果为尿液药物筛查提供了更科学、高效的方法，有望简化分析流程，减少繁琐的样品预处理步骤，在法医毒理学和临床药物检测等领域具有重要的应用价值。