诺如病毒检测新进展：RT-qPCR 与感染性评估的关联研究

研究人员为解决诺如病毒（HuNoV）检测难题，以杜兰病毒为替代开展研究，发现 RT-qPCR 与感染性检测方法间关联，助力食品安全评估。

　　诺如病毒（HuNoV）作为全球急性胃肠炎的主要 “元凶”，在食品安全领域掀起阵阵波澜。它常常 “潜伏” 在受粪便污染的食物中，尤其是那些无需烹饪即可食用的食品、冷冻浆果和贝类。一旦人们误食，就可能引发恶心、呕吐、腹泻等不适症状。

然而，目前在诺如病毒的检测上，却面临着诸多困境。由于缺乏可靠的培养系统，逆转录聚合酶链反应（RT-PCR）成为检测和定量 HuNoV 的 “金标准” 技术。但它有个致命的缺陷，无法区分样本中具有感染性和无感染性的病毒颗粒，也难以辨别游离的病毒 RNA，这就容易导致假阳性结果，使得我们对病毒风险的评估犹如雾里看花。

为了突破这些困境，来自美国佛罗里达大学（University of Florida）的研究人员挺身而出。他们以杜兰病毒作为 HuNoV 的可培养替代物，开展了一项极具意义的研究。该研究成果发表在《Food and Environmental Virology》杂志上，为我们进一步了解诺如病毒检测与感染性评估之间的关系点亮了一盏明灯。

在研究过程中，研究人员主要运用了以下关键技术方法：
首先是病毒培养与纯化技术，通过感染恒河猴肾细胞系（LLC-MK2）来培养杜兰病毒，并利用碘克沙醇梯度超速离心法进行纯化。其次，采用了多种检测技术，如空斑试验（plaque assay）和 50% 组织培养感染剂量（TCID₅₀）试验来评估病毒感染性，运用实时荧光定量逆转录聚合酶链反应（RT-qPCR）对病毒核酸进行定量检测。此外，还借助透射电子显微镜（TEM）和动态光散射（DLS）技术对病毒进行表征分析。最后，运用一系列统计分析方法，包括回归分析、相关性分析等，来深入探究不同检测方法之间的关系。

研究结果如下：

1. 病毒库存表征：经过碘克沙醇梯度超速离心法纯化后，杜兰病毒的最终浓度达到 9.5 log PFU/ml。DLS 和 TEM 分析显示，纯化后的病毒颗粒主要为单分散状态，直径约为 36±6nm，这表明病毒的纯度较高。
2. 感染性测定：通过空斑试验和 TCID₅₀试验对杜兰病毒工作库存进行定量分析，结果显示空斑试验测得的浓度为 6.72±0.10 log₁₀ PFU/ml，TCID₅₀试验测得的浓度为 5.81±0.18 log₁₀ TCID₅₀/ml。研究发现，稀释水平对 log₁₀ TCID₅₀:PFU 比值有显著影响，不过预测值和观察值之间具有较好的一致性，只是个体预测存在一定的变异性。
3. 基因组拷贝数估计：研究人员通过 RT-qPCR 对系列稀释的杜兰病毒转录本进行检测，从而建立校准曲线以估计样本中的基因组拷贝数（GC）。为确保测量精度，他们排除了 Ct 值大于 40 的数据。研究发现，在预测 log₁₀ GC 时，纳入高 Ct 值数据可能会导致高估，不过两种预测方法产生的差异较小，对病毒定量的影响不大。
4. RT-qPCR 检测杜兰病毒（有无 RNase 预处理）：研究人员对系列稀释的病毒库存进行了有无 RNase 预处理的 RT-qPCR 检测。结果发现，无论是否经过 RNase 预处理，样本的 log₁₀ GC 与 log₁₀ PFU/reaction 之间都呈现出很强的正相关性。不过，经过 RNase 预处理的样本，其病毒检测结果与感染性测定结果更为接近。

研究结论和讨论部分指出，本研究为评估基于核酸和基于培养的诺如病毒定量技术的预测能力奠定了基础。杜兰病毒作为 HuNoV 的替代物，在评估不同检测技术之间的关系方面发挥了重要作用。RNase 预处理虽然在一定程度上降低了受损病毒颗粒或暴露病毒 RNA 对 RT-qPCR 信号的影响，使得 RT-qPCR 结果与感染性测定结果更具可比性，但它在区分完整病毒颗粒的感染性方面仍存在局限性。未来，还需要进一步研究，评估 RNase 预处理与其他预处理方法（如 PMA 和猪胃粘蛋白）的适用性，以减少病毒感染性评估中的不确定性和变异性，从而完善微生物风险评估框架，提升对高风险食品中 HuNoV 的监测、预防和控制能力。