术前滑膜液培养检测表皮葡萄球菌对假体周围关节感染诊断价值几何？

本文研究发现术前滑膜液培养对诊断表皮葡萄球菌（S. epidermidis）相关假体周围关节感染（PJI）有重要价值。

　　

引言

假体周围关节感染（PJI）是一种棘手的医学病症，发病率和死亡率较高。全髋关节置换术后 PJI 患者 1 年和 5 年的总体生存率分别为 88.7% 和 67.2%，全膝关节置换术后则为 91.7% 和 71.7%，而且其发病率预计还会上升。

治疗决策，像手术策略和抗菌药物方案的选择，很大程度上依赖于术前诊断评估结果，这其中包括细胞学检查、炎症标志物检测以及微生物学分析。在这些评估手段里，术前滑膜液的微生物学检测结果起着关键作用。不过，由于患者之前使用过抗生素、样本采集前准备不充分，以及存在与生物膜形成表型相关的生长缓慢的微生物，使得滑膜液微生物学检测的敏感性常常受到影响。另外，患者样本还可能被皮肤微生物群污染，比如痤疮丙酸杆菌（Cutibacterium spp.）或凝固酶阴性葡萄球菌（CoNS），其中就包括表皮葡萄球菌（Staphylococcus epidermidis），这降低了滑膜液分析的总体特异性。像表皮葡萄球菌这类低毒力物种，通常只有在从两个或更多独立组织样本中培养出来时，才被认为是真正的侵袭性菌株。所以，从术前关节穿刺获取的单个滑膜液样本中检测到表皮葡萄球菌，很难确定其临床意义。之前的研究还表明，术前和术中样本的一致性大约只有 50%，这凸显了准确评估疑似 PJI 病例中表皮葡萄球菌临床相关性的复杂性。

本研究旨在评估从疑似 PJI 病例的术前滑膜液（SF）培养中分离出的表皮葡萄球菌的临床意义，并探究其分离对诊断表皮葡萄球菌 PJI 的准确性。研究还假设，表皮葡萄球菌分离的诊断准确性取决于它是从直接滑膜液培养（DC）还是仅从肉汤增菌培养（BEC）中分离出来的。

方法

1. 研究设计和患者：对 2019 年 1 月至 2021 年 1 月在德国汉堡 Helios ENDO-Klinik 因疑似 PJI 接受全髋关节（THA）、膝关节（TKA）、肩关节或肘关节置换翻修手术的成年患者进行回顾性研究。纳入标准为有术前 12 个月内的滑膜液培养结果，且术前未使用抗生素。PJI 的定义依据欧洲骨关节感染学会（EBJIS）的标准，并根据微生物学标准对 PJI 患者进行分类。该研究获得了汉堡医学委员会伦理委员会的批准。
2. 实验室和微生物学分析：在确定性手术前无菌采集滑膜液样本，至少 1mL 样本用于微生物学分析。直接培养（DC）时，将至少 50μl 滑膜液分别接种在哥伦比亚羊血琼脂、巧克力琼脂（用于检测需氧菌和酵母菌）以及哥伦比亚羊血琼脂（用于培养厌氧菌）上，在 37°C、5% CO₂和厌氧条件下分别培养长达 14 天，在 24h、48h、7 天和 14 天观察平板生长情况。同时，用 500μl 滑膜液接种 9ml 硫乙醇酸盐肉汤和 8ml 脑心浸液肉汤（BHI）进行肉汤增菌培养（BEC）。所有微生物都通过基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱（MALDI-ToF）进行物种鉴定，必要时使用 Vitek 2 系统或梯度扩散法（依据 EUCAST 协议）进行抗菌药物敏感性测试。从至少两个术中组织标本中分离出表皮葡萄球菌，才被认定为确诊的表皮葡萄球菌 PJI。如果滑膜液培养和术中组织标本分离出的表皮葡萄球菌具有相同的抗菌耐药模式，则认为它们具有克隆同一性。
3. 数据收集：从医疗记录中回顾性收集患者的人口统计学、临床、临床化学和微生物学数据。
4. 统计分析：描述性分析中，正态分布的连续变量以均值 ± 标准差（SD）表示，非正态分布的连续变量以中位数（四分位数间距）表示，分类变量以比例（百分比）表示。使用单因素方差分析（ANOVA）比较滑膜液培养结果不同的三组患者（滑膜液培养表皮葡萄球菌阳性、滑膜液培养其他细菌阳性、滑膜液培养阴性）的基线连续变量（如年龄、C 反应蛋白水平和滑膜液白细胞计数），使用 Kruskal-Wallis 检验分析非参数连续变量和有序变量（如窦道的存在和术中组织学感染阳性）。通过与术中培养分离出的具有临床意义的表皮葡萄球菌对比，评估滑膜液中表皮葡萄球菌检测对诊断表皮葡萄球菌 PJI 的敏感性、特异性、总体准确性以及相应的双侧 95% Wald 置信区间（95% CI）。此外，还计算阳性似然比（LR+）和阴性似然比（LR-）来优化滑膜液中表皮葡萄球菌检测的诊断效用。分别计算通过 DC 或 BEC 检测滑膜液中表皮葡萄球菌以及仅通过 DC 检测时的诊断准确性参数。如果滑膜液中鉴定出的表皮葡萄球菌抗菌药物敏感性测试（AST）谱与组织培养（TC）中的一致，则认定为真阳性；如果滑膜液中表皮葡萄球菌的 AST 谱不同，或者滑膜液检测到表皮葡萄球菌而术中未检测到或检测到其他细菌，则为假阳性；如果表皮葡萄球菌仅在术中培养出现而滑膜液中未出现，则为假阴性；如果滑膜液和组织培养分离出不同细菌或均无菌生长，则为真阴性。通过计算 Cohen's kappa 系数 κ 分析滑膜液和术中组织标本中表皮葡萄球菌分离的一致性，并依据已发表标准进行解释（κ≤0 表示无一致性；κ = 0.01 - 0.20 表示无到低度一致性；κ = 0.21 - 0.40 表示中等一致性；κ = 0.41 - 0.60 表示中度一致性；κ = 0.61 - 0.80 表示高度一致性；κ = 0.81 - 1.00 表示几乎完美一致）。如果滑膜液和术中组织样本中均检测到克隆同一性的表皮葡萄球菌（至少两个术中样本表皮葡萄球菌检测阳性），则认为培养结果一致。所有未进行抗菌药物敏感性测试的表皮葡萄球菌分离株均排除在研究之外。

结果

1. 滑膜液中表皮葡萄球菌的检测：292 例患者纳入研究，其中 95 例（32.5%）术前滑膜液培养检测到表皮葡萄球菌。在这 95 例中，42 例（44.2%）从直接培养（DC）中分离出，53 例（55.8%）仅从肉汤增菌培养（BEC）中分离出。95 例分离株中有 63 例（66.3%）为耐甲氧西林表皮葡萄球菌（DC 分离株中 29/42 [69.1%]，BEC 分离株中 34/53 [64.2%]）。126 例（43.2%）滑膜液培养生长出除表皮葡萄球菌外的其他病原体（SF-other），71 例（24.3%）滑膜液培养结果为阴性（SF-negative）。SF-other 组中最常见的病原体是痤疮丙酸杆菌，在 35 例（27.7%）中被鉴定出，其次是除表皮葡萄球菌外的凝固酶阴性葡萄球菌（25.4%）和链球菌（19%）。SF-epi、SF-other 和 SF-negative 三组在性别、年龄、受累关节、术中组织学感染阳性和窦道存在方面的分布无统计学差异。SF-negative 组的炎症指标较低，且该组确诊 PJI 的患者比例显著低于 SF-epi 组和 SF-other 组（分别为 87.3%、91.6%、96.8%）。294 例患者中有 12 例不符合 EBJIS 的 PJI 标准（SF-epi 组 7 例 [7.2%]；SF-other 组 1 例 [0.8%]；SF-negative 组 4 例 [5.6%]）。292 例患者中，38 例（13%）接受清创、抗生素和植入物保留（DAIR）治疗，225 例（77.1%）接受一期翻修，29 例（9.9%）接受二期翻修。
2. 术中组织标本中具有临床意义的表皮葡萄球菌的检测：术中收集的组织样本中位数为 8 个（IQR 7 - 10）。292 例患者中有 88 例（30.1%）从两个独立组织标本中分离出具有临床意义的表皮葡萄球菌，确诊为表皮葡萄球菌 PJI（TC-epi）。149 例患者组织标本生长出除表皮葡萄球菌外的其他病原体（TC-other），55 例组织培养未发现细菌生长（TC-negative）。术中分离出的表皮葡萄球菌中，61/88（69.3%）为耐甲氧西林菌株。
3. SF-epi 与组织标本培养结果的比较：术前滑膜液培养与术中组织培养的微生物学结果总体一致性为 193/292（66.1%）。对 95 例 SF-epi 病例进行详细分析并考虑 AST 谱以评估表皮葡萄球菌分离株的克隆同一性，发现其中 67 例（70.5%）（DC 组 34 例；BEC 组 33 例）滑膜液中表皮葡萄球菌的存在得到术中培养证实。8 例（8.4%）SF 和 TC 中表皮葡萄球菌的 AST 谱存在差异，被认为不相关。6 例（6.3%）SF-epi 患者术中组织样本生长出其他微生物（DC 组 1 例；BEC 组 5 例），14 例 SF-epi 患者组织培养为阴性。反之，88 例确诊表皮葡萄球菌 PJI 患者中有 12 例滑膜液未培养出表皮葡萄球菌。滑膜液培养诊断表皮葡萄球菌 PJI 的准确性为 83.2%（95% CI：78.4 - 87.3），敏感性为 76.1%（95% CI：65.9 - 84.6），特异性为 86.3%（95% CI：80.8 - 90.7）。仅考虑 DC 阳性的 SF-epi 病例时，特异性提高到 94.2%（95% CI：90.1 - 97），但敏感性降至 40.5%（95% CI：29.9 - 51.7），准确性降至 78.8%（95% CI：73.6 - 83.3）。有趣的是，仅考虑从 DC 分离出的表皮葡萄球菌时，阳性似然比（LR+）为 7；当同时考虑 DC 和 BEC 时，LR + 降至 5.5。Cohen's Kappa 分析显示，DC 和 BEC 联合时，滑膜液培养和术中培养一致性较强（κ = 0.67，一致性百分比为 83.2%）；仅考虑 DC 时，一致性为中等（κ = 0.4，一致性百分比为 78.8%）。

讨论

病原体检测是 PJI 诊断的基础，它不仅是感染的关键判定标准，还能为针对性抗菌治疗和手术治疗策略的选择提供重要信息。虽然对于低毒力微生物的明确微生物学诊断，通常需要采取侵入性措施（如关节切开术），但滑膜液是 PJI 诊断评估中相对容易获取的标本，术前滑膜液穿刺也是 EBJIS 推荐的方法。根据 EBJIS 诊断 PJI 的标准，滑膜液培养阳性且伴有至少一项其他诊断结果，可作为可能 PJI 的分类标准。然而，由于样本采集和处理过程中存在污染风险，仅依靠单次滑膜液穿刺阳性来检测 PJI 病原体存在一定风险，对于表皮葡萄球菌的鉴定尤为如此，它是临床微生物学中样本污染的典型原因。鉴于此，本研究评估了滑膜液培养检测表皮葡萄球菌对预测表皮葡萄球菌所致 PJI 的诊断准确性。增菌技术虽可提高诊断敏感性，但仅在 BEC 中培养出表皮葡萄球菌时，其临床意义常存疑问，所以本研究区分了通过固体琼脂培养和肉汤增菌培养检测到表皮葡萄球菌的情况。

总体而言，本研究中滑膜液培养（SF-C）和组织培养（TC）的微生物学结果一致性为 66%，这与已发表研究中 52 - 79% 的一致性相符。对于确诊的表皮葡萄球菌 PJI 病例，SF-C 和 TC 的总体一致性为 70.5%，不过文献中关于 SF-C 和 TC 检测表皮葡萄球菌一致性的报道较少，且一致性范围在 35 - 95% 之间。培养分析的敏感性和特异性受样本运输（储存时间、运输时间）、实验室标本处理（如组织匀浆、滑膜液离心）和培养条件（如用于接种生长培养基的样本体积、培养基类型、培养时间）等多种因素影响。在日常实践中，不同中心的这些因素差异较大，因此评估当地诊断流程和程序对于判断滑膜液或组织培养阳性和阴性结果的意义至关重要。

本研究的一个重要发现是，滑膜液培养检测表皮葡萄球菌的特异性、阳性似然比和准确性明显取决于该微生物是在固体琼脂平板上被检测到，还是仅在肉汤增菌后被检测到。在临床检查中，需要对微生物学结果进行更详细的评估，以正确解释其临床意义。例如，滑膜液直接培养（SF-DC）检测表皮葡萄球菌的高特异性（94.2%）强烈提示其临床意义；而较低的特异性（76.1%）表明，虽然 BEC 对于获得可接受的敏感性和准确性是必要的，但从 SF-BEC 中分离出的表皮葡萄球菌的临床意义仍值得怀疑。因此，在这些情况下，必须结合临床症状和滑膜液参数（如白细胞酯酶、白细胞计数、α - 防御素）来正确解释临床结果。

基于本研究结果，有必要通过重新审视滑膜液培养标准，为 EBJIS 可能的 PJI 标准增加微生物学定量维度，至少对于来自皮肤微生物群的低毒力微生物应如此，这可能有助于提高 EBJIS PJI 定义的准确性。更普遍地说，本研究关于表皮葡萄球菌培养的结果表明，迫切需要在 PJI 诊断中建立严格、明确的微生物学阳性培养定义。

本研究存在一些局限性。并非所有进行 PJI 诊断初次滑膜液分析的患者都被纳入，仅纳入了后续接受手术的患者。此外，本研究中 PJI 分离病原体的相对分布与其他报道不同，低毒力病原体感染的比例过高。在微生物学分析方面，本研究依赖表型标准评估滑膜液或组织培养中表皮葡萄球菌的克隆同一性，但近期研究表明，由于感染过程中的持续基因适应，表型耐药谱可能在感染过程中发生显著变化，这使得该标准的准确性受到质疑。因此，在未来研究中，为明确滑膜液培养和组织培养中表皮葡萄球菌的克隆关系，全基因组测序是必要的。另外，本研究采用严格标准定义表皮葡萄球菌 PJI（即从两个独立活检中检测到表皮葡萄球菌），这可能导致对研究人群中表皮葡萄球菌 PJI 真实患病率的低估。

综上所述，研究数据支持术前滑膜液培养在大量 PJI 病例中有助于识别病原体的观点。具体而言，直接培养检测到表皮葡萄球菌提示可能存在表皮葡萄球菌 PJI，但诊断敏感性较低。为达到临床有用的诊断敏感性和准确性，至少对于表皮葡萄球菌，DC 和 BEC 联合使用是必要的。然而，由于这种微生物学检测方法特异性较低，在判断临床意义时，必须对患者进行全面评估，包括临床症状和滑膜液参数。此外，对于表皮葡萄球菌，术前滑膜液培养在多大程度上可作为抗菌治疗策略决策的依据仍有待商榷。