一种可调谐且多功能的化学遗传近红外荧光报告分子：为生命科学研究带来新曙光

在生命科学研究中，近红外（NIR）荧光蛋白存在一些问题，如依赖内源性发色团胆绿素（biliverdin）且结合效率低、尺寸较大等。为解决这些问题，研究人员开展了化学遗传近红外荧光报告分子的研究。他们开发出 nirFAST，其具有多种优势，为生物成像和细胞研究提供了有力工具。

　　在生命科学的研究进程中，生物成像技术一直是探索细胞和生物体内微观世界的关键手段。近红外（NIR）荧光成像凭借其高对比度、低光毒性以及能深入生物组织的特性，成为了研究的热点方向。然而，现有的基于细菌光敏色素改造的近红外荧光蛋白（FPs）却存在诸多限制。它们依赖内源性发色团胆绿素（biliverdin），但胆绿素在细胞中的浓度不稳定，且其结合到荧光蛋白的效率较低、动力学缓慢，这使得荧光蛋白在细胞内的亮度表现不佳。此外，这些荧光蛋白的尺寸通常较大，约 35kDa，在与目标蛋白融合时，可能会干扰目标蛋白的正常功能。因此，开发一种更高效、稳定且对细胞影响小的近红外荧光报告分子迫在眉睫。

为了解决这些难题，来自法国索邦大学（Sorbonne Universite）、居里研究所（Institut Curie）等多个机构的研究人员展开了深入研究。他们成功开发出一种名为 nirFAST（near-infrared fluorescence-activating and absorption-shifting tag）的化学遗传近红外荧光报告分子，并将相关研究成果发表在《Nature Communications》上。这一成果为生物成像和细胞生物学研究带来了新的突破，具有重要的意义。

在研究方法上，研究人员主要运用了以下几种关键技术：一是通过定点突变和酵母表面展示技术，对蛋白进行定向进化，筛选出与合成荧光发色团结合能力更强、荧光亮度更高的蛋白变体；二是利用同源建模和分子动力学模拟，构建 nirFAST 的结构模型，深入分析其与发色团的相互作用机制；三是运用荧光显微镜、共聚焦显微镜、受激发射损耗（STED）纳米显微镜等多种成像技术，对 nirFAST 在细胞和组织中的成像性能进行全面评估；四是借助流式细胞术，分析蛋白之间的相互作用以及荧光互补效率。

研究结果如下：

• 光谱性能优化：nirFAST 由一个 14kDa 的小蛋白和合成荧光发色团 4 - 羟基 - 3,5 - 二甲氧基苯亚甲基罗丹宁（HPAR - 3,5DOM）或 4 - 羟基 - 3 - 甲氧基苯亚甲基罗丹宁（HPAR - 3OM）组装而成。通过对发色团结构改造和蛋白的两轮定向进化，获得了具有理想光谱性能的 nirFAST。其中，nirFAST715（与 HPAR - 3,5DOM 结合）的吸收峰为 636nm，发射峰为 715nm；nirFAST680（与 HPAR - 3OM 结合）的吸收峰为 604nm，发射峰为 680nm，且两者都具有较高的荧光亮度和良好的光稳定性。
• 细胞内成像优势：在培养的哺乳动物细胞中，nirFAST 标记的蛋白能够均匀分布，且不影响蛋白的细胞定位。与其他近红外荧光蛋白相比，nirFAST680 和 nirFAST715 在 633nm 激发下更亮。同时，nirFAST 可与多种可见荧光报告分子组合，实现多色成像，如与增强型青色荧光蛋白（ECFP）、pFAST540 和 mCherry 结合，能在活细胞中同时可视化四个细胞靶点。
• 超分辨率成像能力：借助 STED 纳米显微镜，nirFAST600（与 HBR - 3,5DOM 结合）和 nirFAST680 能够对活细胞中的微管等精细结构进行亚衍射成像，分辨率比传统共聚焦显微镜提高了 1.6 倍，展现出其在超分辨率成像方面的优势。
• 在生物体内的应用潜力：在鸡胚胎组织和斑马鱼幼虫实验中，nirFAST 能够高效标记蛋白，实现对生物过程的清晰成像。例如，在鸡胚胎神经管细胞分裂过程中，可同时监测核 H2B - pFAST540、膜锚定 mCherry 和线粒体定位 nirFAST715 的动态变化；在斑马鱼幼虫中，可检测到注射的表达 nirFAST 的 HEK293T 细胞，证明其在体内成像的适用性。
• 细胞周期监测与蛋白定位控制：利用 nirFAST715 和 pFAST540 的正交性，构建了绿色 - 近红外荧光泛素化细胞周期指示剂（FUCCI），可实时监测细胞周期不同阶段。此外，通过将 nirFAST 进行二分，开发出 nirCATCHFIRE 技术，能够利用近红外荧光读数控制和可视化蛋白质的接近程度，如控制溶酶体的定位。

研究结论和讨论部分指出，nirFAST 作为一种新型化学遗传近红外荧光报告分子，具有诸多显著优势。它克服了传统近红外荧光蛋白的不足，在多种生物环境中表现出色，为生物成像提供了更多选择。其尺寸小、荧光激活迅速的特点，使其在标记蛋白时对细胞的扰动极小，且能实时追踪动态生物过程。在细胞周期监测和蛋白质定位控制方面的应用，也为细胞生物学研究开辟了新的途径。同时，nirFAST 在多色成像和超分辨率成像中的良好性能，有助于深入探究细胞和组织的微观结构与功能。总体而言，nirFAST 为生命科学研究提供了强大的技术支持，有望推动生物医学领域的进一步发展。