Enhanced RNA-targeting CRISPR-Cas technology in zebrafish：优化斑马鱼 RNA 靶向 CRISPR-Cas 技术，解锁体内应用新潜能
编辑推荐：
在基因编辑领域，CRISPR-Cas13 系统应用广泛却存在争议。为解决其在体内应用的局限，研究人员以斑马鱼为模型优化该技术。他们发现化学修饰的 gRNA 可增强效果，还评估了多种系统。这为优化 RNA 靶向技术及推动体内应用意义重大。
基因编辑技术的发展为生命科学研究带来了革命性的变化，其中 CRISPR-Cas 系统更是成为了科研人员手中的有力工具。CRISPR-Cas13 作为一种 RNA 靶向系统，在基础和应用科学领域有着广泛的应用前景，比如在基因功能研究、疾病治疗等方面都展现出了巨大的潜力。然而，它并非十全十美。在哺乳动物细胞和小鼠模型的研究中发现，CRISPR-Cas13 存在一些令人担忧的问题。其一，它具有 collateral activity，这意味着在切割目标 RNA 时，可能会 “误杀” 其他非目标 RNA，从而干扰细胞内正常的 RNA 代谢过程，引发一系列不可预测的后果；其二，该系统在体内的靶向能力还有待提高，效率不稳定，这极大地限制了其在体内的应用，特别是在需要精准调控基因表达的生物医学和生物技术领域。
为了攻克这些难题，来自西班牙安达卢西亚发育生物学中心（Andalusian Center for Developmental Biology，CABD）等多个研究机构的研究人员开展了一项深入的研究，旨在优化 RNA 靶向的 CRISPR-Cas 技术，提高其在斑马鱼体内的应用效果。他们以斑马鱼胚胎为模型系统，通过一系列实验，成功地对 CRISPR-Cas 技术进行了优化，并取得了一系列重要成果。该研究成果发表在《Nature Communications》上，为 CRISPR-Cas 技术在体内的应用提供了新的思路和方法。
研究人员在研究过程中用到了多个主要关键的技术方法。在实验动物方面，使用了斑马鱼野生型菌株 AB/Tübingen（AB/Tu）或 Tupfel long fin（TLF），其胚胎来自随机父母交配。在基因编辑工具构建上，设计并合成了多种 gRNA，包括化学修饰的 gRNA（cm - gRNA）和体外转录的 gRNA（IVTed gRNA） ，同时制备了 RfxCas13d 等多种 Cas 蛋白。还运用了斑马鱼胚胎显微注射技术，将相关的 mRNA、蛋白和 gRNA 注入胚胎。实验结束后，通过 qRT - PCR、RNAseq 等技术对基因表达水平进行检测分析 。
下面来看具体的研究结果：
- CRISPR - RfxCas13d 向导 RNA 优化：研究人员发现，在斑马鱼胚胎发育过程中，CRISPR - RfxCas13d 系统在靶向母源提供和早期转录的 mRNA 时表现出较高活性，但在消耗受精后 7 - 8 小时（hpf）后表达的基因时效率较低。通过实验对比，他们发现化学修饰的 gRNAs（cm - gRNAs）与 RfxCas13d mRNA 结合，能显著提高对发育后期表达基因的 mRNA 靶向效率，增加基因功能缺失表型的外显率。而部分 IVTed gRNAs 会在胚胎发育过程中引发毒性效应，不过这种毒性可以通过使用化学合成的 gRNAs 或对 IVTed gRNAs 进行体外 rRNA 完整性检测来避免。
- 增强 CRISPR - RfxCas13d 对核 RNA 的消耗：为了提高对核 RNA 的靶向能力，研究人员对 RfxCas13d 进行了优化，添加了核定位信号（NLS）。实验结果显示，带有特定 NLS（SV40 - Nucleoplasmin long NLS）的 RfxCas13d - 2C - NLS 能够有效耗尽斑马鱼胚胎中的核 RNA，如 pri - miR - 430 和 u4atac snRNA，这表明优化后的系统可以增强对核 RNA 的靶向和降解作用。
- 评估预测 CRISPR - RfxCas13d 活性的计算模型：研究人员比较了几种基于哺乳动物细胞培养数据开发的计算模型，以评估它们预测 CRISPR - RfxCas13d 在体内活性的准确性。结果发现，RNAtargeting 模型在分类 CRISPR - RfxCas13d 核糖核蛋白（RNP）复合物活性方面表现最佳，但仍存在一定的局限性，只能适度准确地预测 CRISPR - RfxCas13d 在体内的活性。
- 分析 CRISPR - RfxCas13d 的附带活性：研究人员发现，当 CRISPR - RfxCas13d 系统靶向高浓度的报告基因（如绿色荧光蛋白，GFP）mRNA 时，会引发附带活性，导致胚胎发育缺陷、28S rRNA 裂解以及转录组的全局失调。然而，在靶向内源性 mRNA 时，即使是高丰度的内源性 mRNA，CRISPR - RfxCas13d 的附带活性也极小，且没有明显的生理影响。
- 评估替代的 CRISPR - Cas 系统：考虑到 RfxCas13d 的附带活性可能会影响其在体内的应用，研究人员对其他 RNA 靶向的 CRISPR - Cas 系统进行了评估，包括 CRISPR - Cas7 - 11、CRISPR - DjCas13d 和高保真版本的 RfxCas13d（Hf - RfxCas13d）。结果表明，DjCas13d 和 Cas7 - 11 在体内具有较高的靶向效率，且附带效应较低或不存在，可作为替代 RfxCas13d 的潜在选择 。
在研究结论和讨论部分，研究人员通过多种优化策略，显著提升了 CRISPR - Cas RNA 靶向技术在斑马鱼体内的应用效果。cm - gRNAs 不仅能增强对特定基因的靶向能力，还为相关研究提供了新的技术手段。对核 RNA 靶向的优化，为研究核内 RNA 的功能和调控机制提供了有力工具。虽然 RNAtargeting 模型在预测 gRNA 活性方面有一定作用，但仍需开发更精准的计算模型。此外，研究还明确了 CRISPR - RfxCas13d 的附带活性特点，并发现了 CRISPR - Cas7 - 11 和 CRISPR - DjCas13d 等替代系统的优势。这些成果不仅有助于深入理解 CRISPR - Cas 系统在斑马鱼胚胎中的作用机制，也为优化该技术在体内的应用提供了重要依据，为未来的生物医学和生物技术研究奠定了坚实基础，有望推动相关领域的进一步发展。
濠电偞鍨堕幐鎼侇敄閸緷褰掑炊閳规儳浜鹃柣鐔煎亰濡插湱鈧鎸哥€涒晝鈧潧銈搁弫鍌炴倷椤掍焦鐦庨梺璇插缁嬫帡宕濋幒妤€绀夐柣鏃傚帶杩濇繝鐢靛Т濞茬娀宕戦幘鎰佹僵鐎规洖娲ㄩ悾铏圭磽閸屾瑧顦︽俊顐ｇ矒瀹曟洟顢旈崨顖ｆ祫闂佹寧绻傞悧鎾澄熺€ｎ喗鐓欐繛鑼额嚙楠炴﹢鏌曢崶銊ュ摵鐎殿噮鍓熼獮宥夘敊閻ｅ本娈搁梻浣藉亹閻℃棃宕归搹顐ｆ珷闁秆勵殕椤ュ牓鏌涢幘鑼槮濞寸媭鍨堕弻鏇㈠幢濡ゅ﹤鍓遍柣銏╁灡婢瑰棗危閹版澘顫呴柣娆屽亾婵炲眰鍊曢湁闁挎繂妫欑粈瀣煃瑜滈崜姘┍閾忚宕查柛鎰ㄦ櫇椤╃兘鏌ㄥ┑鍡欏ⅵ婵☆垰顑夐弻娑㈠箳閹寸儐妫￠梺璇叉唉婵倗绮氶柆宥呯妞ゆ挾濮烽鎺楁⒑鐠団€虫灁闁告柨楠搁埢鎾诲箣閿旇棄娈ュ銈嗙墬缁矂鍩涢弽顓熺厱婵炲棙鍔曢悘鈺傤殽閻愬弶鍠橀柟顖氱Ч瀵噣宕掑Δ浣规珒
10x Genomics闂備礁鎼崐鐟邦熆濮椻偓楠炴牠鈥斿〒濯爄um HD 闁诲孩顔栭崰鎺楀磻閹剧粯鐓曟慨妯煎帶閻忕姷鈧娲滈崰鎾舵閹烘骞㈡慨姗嗗墮婵啴姊洪崨濠傜瑨婵☆偅绮嶉妵鏃堝箹娴ｇ懓浠㈤梺鎼炲劗閺呮粓鎮鹃柆宥嗙厱闊洤顑呮慨鈧┑鐐存綑濡粓濡甸幇鏉垮嵆闁绘ḿ鏁搁悡浣虹磽娴ｅ憡婀版俊鐐舵铻為柛褎顨呯粈鍡涙煕閳╁啞缂氶柍褜鍏涚划娆撳极瀹ュ鏅搁柨鐕傛嫹
婵犵數鍋涘Λ搴ㄥ垂閼测晜宕查悗锝庡亞閳绘棃鎮楅敐搴″箺缂佷胶娅墂ist闂備線娼уΛ妤呮晝閿濆洨绠斿鑸靛姇濡ɑ銇勯幘璺轰粶缂傚秳绶氶弻娑㈠冀閵娧冣拡濠电偛鐗婇崢顥窱SPR缂傚倷鐒︾粙鎺楁儎椤栫偛鐒垫い鎺嗗亾妞わ缚鍗抽幃褔宕妷銈嗗媰闂侀€炲苯澧村┑鈥愁嚟閳ь剨缍嗛崜姘跺汲閳哄懏鍊垫繛鎴炵懃婵啴鏌涢弮鎾村
闂備礁鎲￠〃鍡椕哄⿰鍛灊闊洦绋掗崵鍕煟閹邦剦鍤熼柕鍫熸尦楠炴牠寮堕幋鐘殿唶闂佸憡鐟ュΛ婵嗩潖婵犳艾惟闁靛绲煎ù鐑芥煟閻樿京鍔嶇憸鏉垮暣閹儵鏁撻敓锟� - 婵犵數鍎戠徊钘夌暦椤掑嫬鐭楅柛鈩冡缚椤╂煡鏌涢埄鍐惧毀闁圭儤鎸鹃々鐑藉箹鏉堝墽绉甸柛搴㈠灥閳藉骞橀姘濠电偞鍨堕幖鈺傜濠婂啰鏆﹂柣鏃囨绾惧ジ鏌涢埄鍐闁告梹甯￠幃妤呭捶椤撶偘妲愰梺缁樼⊕閻熝囧箯鐎ｎ喖绠查柟浼存涧閹線姊洪崨濠傜濠⒀勵殜瀵娊鎮㈤悡搴ｎ唹濡炪倖鏌ㄩ悘婵堢玻濞戙垺鐓欓悹銊ヮ槸閸婂鎮烽姀銈嗙厱婵炲棙锚閻忋儲銇勯銏╁剶鐎规洜濞€瀵粙顢栭锝呮诞鐎殿喗鎮傞弫鎾绘晸閿燂拷
濠电偞鍨堕幐鎼侇敄閸緷褰掑炊椤掆偓杩濇繝鐢靛Т鐎氼噣鎯屾惔銊︾厾鐎规洖娲ゆ禒婊堟煕閻愬瓨灏﹂柟钘夊€婚埀顒婄秵閸撴岸顢旈妶澶嬪仯闁规壋鏅涙俊铏圭磼閵娧冾暭闁瑰嘲鎳庨オ浼村礃閵娧€鍋撴繝姘厸閻庯綆鍋勬慨鍫ユ煛瀹€鈧崰搴ㄥ煝閺冨牆鍗抽柣妯挎珪濮ｅ嫰鏌ｆ惔銏⑩姇闁告梹甯″畷婵嬫偄閻撳宫銉╂煥閻曞倹瀚�
