磷酸依赖的核输出新机制：Msn5 识别非经典 NES 的关键作用

在细胞信号传导中，基因表达受核转运调控，磷酸化在其中意义重大。为探究相关机制，研究人员以酵母为模型研究 Msn5 介导的核输出。结果发现 Pho4 的非经典核输出信号（NES）及结合机制，这有助于理解核输出调控及细胞信号通路。

　　细胞内的基因表达就像一场精准的交响乐演奏，而环境刺激则如同指挥家的指挥棒，引导着这场演奏的节奏。在这个过程中，关键信号成分在细胞核与细胞质之间的穿梭起着至关重要的作用，它们就像是传递指令的信使，确保细胞能够准确地对环境变化做出反应。其中，磷酸化修饰如同给这些信使贴上了特殊的 “标签”，调控着它们的运输和功能。

在众多参与核质运输的 “角色” 中，酵母中的 Msn5（也称为 Kap142）备受关注，它与人类的 Exportin - 5（XPO5）同源，负责运输至少 18 种不同的蛋白质，这些蛋白质涉及营养感知、应激反应以及细胞周期维持等多个重要生理过程。以磷酸盐感应转录因子 Pho4 为例，它的核输出依赖于 Msn5，并且需要特定的磷酸化修饰，但此前 Msn5 与 Pho4 的结合元件、识别模式以及磷酸化与核输出之间的联系机制一直是个谜。

为了揭开这些神秘的面纱，来自美国德克萨斯大学西南医学中心（UT Southwestern Medical Center）、洛克菲勒大学（The Rockefeller University）等机构的研究人员展开了深入的研究。他们的研究成果发表在《Nature Communications》杂志上，为我们理解细胞内的核输出调控机制带来了新的曙光。

研究人员主要运用了冷冻电镜（cryogenic - electron microscopy，cryo - EM）和 RNA 测序（RNAseq）等技术。冷冻电镜能够让研究人员在接近生理状态下观察蛋白质的三维结构，而 RNA 测序则帮助他们分析基因表达的变化情况，从而从结构和功能两个层面深入探究 Msn5 介导的核输出机制。

研究结果

1. Mapping the Msn5 - binding region of Pho4：研究人员构建了一系列 GST 融合的 Pho4 蛋白截短体，通过体外磷酸化和 pull - down 实验，确定了 Pho4 中与 Msn5 结合的最小区域为 1 - 200 氨基酸片段。荧光偏振（FP）分析进一步表明，野生型 mNeonGreen - pPho4_{3 - 200}与野生型 Msn5 具有高亲和力结合。
2. Cryo - EM maps of pPho4_{1 - 200} and pPho4_FL - bound Msn5 reveal Msn5 flexibility：通过冷冻电镜解析 Msn5 - Ran^GTP - pPho4_{1 - 200}和 Msn5 - Ran^GTP - pPho4_FL的三元复合物结构，发现 Msn5 在结合 Pho4 时具有一定的灵活性，不同的复合物结构中 Msn5 螺线管和 Pho4 的构象存在差异，这暗示着它们之间存在动态的相互作用。
3. A 35 - residue NES of Pho4 binds the central concave surface of Msn5：对 Msn5 - Ran^GTP - pPho4_{1 - 200}复合物最紧密状态的 3.0 分辨率结构分析发现，Pho4 存在一个 35 个氨基酸的核输出信号（NES），它沿着 Msn5 的 h8 - h18 螺旋呈锯齿状结合在其中心凹面，该区域包括动态结合区域和核心结合区域。
4. The four regions of the Msn5 - bound Pho4 NES：将 Pho4 的 35 个氨基酸 NES 分为四个区域，每个区域通过特定的氨基酸残基与 Msn5 相互作用。例如，NES 区域 2 和 3 中的疏水和小极性侧链与 Msn5 形成广泛的相互作用，对结合起到重要作用。
5. Msn5 interactions involving Pho4 pS114 and pS128：通过突变实验，研究人员发现 Pho4 的 pS114 和 pS128 与 Msn5 的特定氨基酸残基相互作用，对 Msn5 - Pho4 的结合亲和力至关重要，其中 Msn5 的 RR 位点比 HRY 位点对结合贡献更大。
6. Transcription factor cargoes binding to Msn5 HRY and RR sites regulates expression of downstream genes：为了探究体外研究结果在体内的功能相关性，研究人员通过 RNA 测序分析发现，在 Msn5 突变体中，与 Msn5 HRY 和 RR 位点结合的转录因子货物（如 Pho4 和 Mig1）的下游基因表达发生变化，这表明 Msn5 在调节基因表达方面起着重要作用。
7. Hydrophobic and polar side chains of the Pho4 NES contribute to Msn5 - binding：除了磷酸化丝氨酸，Pho4 NES 中的疏水和小极性侧链也对 Msn5 结合有显著贡献，突变这些非磷酸化丝氨酸残基会降低 Msn5 的结合亲和力。
8. Characteristics of the Pho4 NES and its binding site on Msn5：Pho4 NES 具有一些独特的特征，如位于内在无序区域（IDR）、含有两个间隔 10 个以上残基的潜在磷酸化位点等。与 AlphaFold3 模型比较发现，该模型未能准确预测 Msn5 与 Pho4 的结合模式。此外，Msn5 与 XPO5 的结合位点存在部分重叠，但它们的货物特异性存在差异。
9. Cargo recognition by Msn5 vs XPO5：Msn5 和 XPO5 虽然在结构上有相似之处，但它们识别货物的方式和货物特异性存在明显差异。Msn5 主要识别磷酸化的蛋白质，而 XPO5 主要识别前体 miRNA 等。
10. The Pho4 NES bears no resemblance to the cNES that binds XPO1：Pho4 的 NES 与 XPO1 识别的经典 NES（cNES）在结构、结合位点和结合能量分布等方面存在显著差异，Pho4 NES 的结合模式更类似于脯氨酸 - 酪氨酸（PY）核定位信号（NLS）。
11. Msn5 autoinhibition, pPho4/Ran positive cooperativity and Pho4 release：研究人员还解析了未结合配体的 Msn5 的冷冻电镜结构，发现其处于自抑制状态。Ran^GTP的结合会解除这种自抑制，并且 pPho4 和 Ran^GTP的结合存在正协同效应。此外，Msn5 的 h17loop 在 RanBP1 结合导致的货物释放过程中起着关键作用。

研究结论与讨论

这项研究揭示了 Pho4 的 35 个氨基酸磷酸化 NES 代表了一种非经典的线性 NES，与之前表征的 XPO1 识别的 NES 不同。研究人员详细阐述了它被 Msn5 识别的机制，包括关键的磷酸化丝氨酸残基和众多疏水、极性氨基酸的作用。这一发现不仅解释了 Pho4 磷酸化调节核输出的机制，还为预测其他 Msn5 货物的结合元件提供了线索。

此外，研究还发现未结合配体的 Msn5 是一种自抑制的闭环螺线管结构，这解释了出口蛋白系统中典型的 Ran^GTP和货物结合的正协同效应，以及 RanBP1 介导的货物释放机制。这些研究成果为深入理解核输出调控的多样性以及货物磷酸化在调节核运输和控制细胞信号通路中的关键作用奠定了坚实基础，为后续相关领域的研究开辟了新的方向。