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为评估按蚊属（Anopheles）物种生理差异，研究人员筛选其跨物种和发育阶段的参考基因，成果有助于深入了解蚊虫生物学特性。
研究背景：探索按蚊基因密码，破解疟疾传播谜题
疟疾，这个古老而又致命的疾病，长期以来一直威胁着人类的健康。按蚊作为疟疾的主要传播媒介，其体内的基因表达差异对于理解疟疾的传播机制和防控策略至关重要。按蚊属（Anopheles）中的赫坎按蚊组（Anopheles Hyrcanus Group）包含至少 25 种蚊子，它们在形态和生态位上相似，但在传播疟疾的能力等关键媒介特征上却表现出显著差异。
在韩国的疟疾高风险地区，已发现 6 种赫坎按蚊组蚊子，不同种类在不同季节流行，且对疟原虫的易感性不同。然而，由于这些蚊子栖息地重叠、物种鉴定困难，对它们进行跨物种的比较研究面临诸多挑战。为了深入了解这些蚊子在流行病学上重要的生理学差异，比较它们与病原体相互作用、免疫反应和异生物质代谢相关基因的表达谱势在必行。
定量聚合酶链反应（qPCR）是研究基因表达的常用方法，而选择合适的参考基因对于准确比较目标基因的转录水平至关重要。以往研究多关注单一物种内参考基因的选择，且常用参考基因在不同物种和实验条件下稳定性存在差异。因此，筛选出在赫坎按蚊组不同物种和发育阶段均稳定表达的参考基因迫在眉睫。在此背景下，来自首尔国立大学医学院等机构的研究人员展开了深入研究，其成果发表在《Scientific Reports》上。
研究方法：多管齐下筛选稳定参考基因
研究人员为筛选出合适的参考基因，采用了多种关键技术方法。首先，在韩国京畿道的三个地点，使用黑光诱捕器收集成年蚊子，时间跨度为 2021 - 2023 年的 6 月至 9 月。通过改良的多重 PCR 方法，以内部转录间隔区 2 基因序列为分子标记进行物种鉴定。从每个物种的不同发育阶段（4 龄幼虫、蛹、24 小时龄成年雌蚊、72 小时龄成年雌蚊和混合年龄产卵雌蚊）收集样本并储存。
接着，从 11 个基于以往蚊子转录研究和其他昆虫常用管家基因选择的候选基因入手，设计引物扩增基因片段，对扩增片段进行测序和比对，确定候选基因序列。之后，利用 CLC Main Workbench 8.1.2 软件设计 qPCR 引物，通过测试不同 cDNA 含量评估引物效率。最后，运用 delta Ct?、geNorm、BestKeeper 和 NormFinder 四种归一化方法评估 8 个候选参考基因的稳定性，并使用 RefFinder 确定基因稳定性的总体排名。
研究结果：锁定稳定参考基因，解析表达差异
- 引物设计与效率测试：成功为 10 个候选基因（除 RPS18 外）设计引物，因 RPS18 基因无法找到符合标准的引物而被排除。测试后，RPL49 和 α - tub 引物扩增效率较低被排除，其余引物平均效率在 95.8% - 103.1% 之间，物种特异性效率在 90.7% - 106% 之间，R2≥0.99，满足参考基因标准。
- 基因稳定性评估
- delta Ct?分析：不同物种中最稳定的基因不同，如 RPL8 在按蚊贝氏按蚊（An. belenrae）和克莱尼按蚊（An. kleini）中最稳定；RPS7 在按蚊莱氏按蚊（An. lesteri）中最稳定等。在 4 龄幼虫和产卵雌蚊阶段，RPL13a 最稳定，其他阶段 RPL32 较稳定。
- geNorm 分析：多数情况下使用两个基因进行归一化的 pairwise variation 最小，但按蚊莱氏按蚊和中华按蚊（An. sineroides）使用三个基因时更低。RPL32、RPL8、RPL13a 和 RPS17 组合的 M 值较低，稳定性较高。不同物种中最稳定的基因组合也有所不同，如按蚊贝氏按蚊、中华按蚊和中华按蚊中 RPL32 和 RPS17 最稳定。
- BestKeeper 和 NormFinder 分析：BestKeeper 分析显示，RPS17 是按蚊贝氏按蚊、莱氏按蚊和中华按蚊的最稳定基因，RPS7 是克莱尼按蚊、中华按蚊和中华按蚊的最稳定基因。NormFinder 算法确定不同物种的最稳定基因，如 RPL8 在按蚊贝氏按蚊和克莱尼按蚊中最稳定。在不同发育阶段，两种方法的结果与 delta Ct?方法相似。
- RefFinder 分析：综合四种方法，确定按蚊贝氏按蚊、中华按蚊、中华按蚊和中华按蚊中 RPS17 最稳定，克莱尼按蚊中 RPL8 最稳定，莱氏按蚊中 RPS7 最稳定。还推荐了不同情况下使用的两个参考基因组合。
- 参考基因验证：以几丁质合酶 2（CHS2）和卵黄原蛋白 1（Vg1）为目标基因，用最稳定和最不稳定的参考基因进行 qPCR 归一化比较。结果表明，使用不同参考基因会导致目标基因表达模式不同，进一步证明了选择合适参考基因的重要性。
研究结论与意义：为蚊虫研究和防控提供关键工具
本研究成功鉴定出韩国分布的 6 种赫坎按蚊组物种在 5 个发育阶段的可靠参考基因。在比较幼虫重要生理相关基因表达时，推荐使用 RPL13a + RPL8；在跨物种比较雌蚊多种生理方面时，推荐使用 RPL32 + RPS17 或 RPL32 + RPL13a 作为参考标准。
这些参考基因对于准确比较不同物种或发育阶段的基因表达谱具有重要意义，有助于深入了解按蚊的生物学特性、行为和生理学，如不同物种的媒介能力差异、对病原体的免疫反应以及杀虫剂敏感性等。虽然这些参考基因的适用性还需在其他实验条件下进一步验证，研究范围也有待扩展到更多按蚊物种，但它们无疑为推进蚊虫生物学研究和病媒控制奠定了坚实基础，为未来开发更有效的疟疾防控策略提供了有力支持。
