Plakoglobin 在 cAMP 介导的内皮屏障稳定中的作用新发现：打破传统认知，揭示关键机制

为探究 PG 在 cAMP 介导的内皮屏障稳定中的作用，研究人员建立相关细胞系，发现 PG 及 Ser665 磷酸化并非关键。

　　

研究背景

在人体的微观世界里，血管内皮就像一道精密的 “城墙”，它是一层选择性半透膜，严格控制着血管和周围组织之间的物质交换。这道 “城墙” 的完整性一旦遭到破坏，就如同城墙出现了缺口，会引发一系列严重的健康问题，像炎症、水肿甚至多器官衰竭。

在维持这道 “城墙” 稳定的众多因素中，肌动蛋白细胞骨架的重塑以及细胞连接完整性的精确调控至关重要。而 Plakoglobin（PG）作为一种结构和信号蛋白，与 cAMP、Rho GTPases、肌动蛋白结合蛋白等关键信号分子一起，在血管通透性调节中发挥着重要作用。然而，目前对于 PG 在 cAMP 介导的内皮屏障稳定中的具体作用，科学界还存在诸多疑问。

为了解开这些谜团，来自德国路德维希 - 马克西米利安大学（Ludwig-Maximilians-University，LMU）的研究人员开展了深入研究。他们的研究成果发表在《Scientific Reports》上，为我们理解内皮屏障的调控机制提供了新的视角。

研究方法

研究人员主要采用了以下几种关键技术方法：

• 细胞系建立：通过基因编辑技术，建立了野生型（WT）和 PG 基因敲除（PG-KO）小鼠的心肌内皮细胞系，同时构建了 PG Ser⁶⁶⁵Ala 敲入小鼠来源的内皮细胞系，用于研究 PG 及其磷酸化在不同条件下对内皮屏障功能的影响。
• Transendothelial electrical resistance（TEER）测量：利用该技术定量检测细胞间接触完整性的动态变化，以此评估内皮屏障功能。
• 免疫荧光、Western blot 和 PCR 分析：通过免疫荧光观察蛋白的细胞定位，Western blot 检测蛋白表达水平，PCR 分析 mRNA 丰度，从而探究 PG 缺失或磷酸化改变对相关蛋白和基因表达的影响。
• Rac1 和 RhoA GLISA 激活测定、ELISA：分别用于测定细胞内活性 Rac1 和 RhoA 蛋白的浓度，以及细胞内 cAMP 水平。

研究结果

1. PG 缺失增强内皮屏障完整性：通过 TEER 测量发现，PG-KO 细胞的内皮屏障功能显著增强。免疫荧光分析显示，PG 缺失导致 VE-cadherin 和 β-catenin 向细胞连接处显著积累，其蛋白水平也明显升高，但 mRNA 水平未改变。此外，PG-KO 细胞中 PECAM-1 蛋白表达上调，claudin-5 转录水平降低，claudin-1 mRNA 显著升高。
2. PG 缺失影响细胞内 cAMP 水平但不影响 Rac1 和 RhoA 活性：研究发现，PG 缺失不影响 Epac1、Rac1 和 RhoA 的蛋白表达，Epac1 信号通路也不受影响。然而，PG-KO 细胞内 cAMP 水平显著下降，这表明 PG 可能参与调节细胞内 cAMP 浓度。
3. PG 通过调节 VE-PTP 表达控制 VE-cadherin 磷酸化：免疫荧光和 Western blot 分析表明，PG 缺失使 VE-PTP 蛋白表达增加，VE-cadherin 在 Tyr⁶⁵⁸位点的磷酸化减少。这说明 PG 可通过调节 VE-PTP 表达来控制 VE-cadherin 的磷酸化状态，进而影响内皮屏障功能。
4. cAMP 介导的内皮屏障增强独立于 PG：TEER 测量显示，WT 和 PG-KO 细胞在 cAMP 升高时，TEER 均增加，但 PG-KO 细胞的增加幅度较小。cAMP 升高还导致 WT 细胞中 VE-cadherin 和 β-catenin 向连接处积累，而 PG-KO 细胞中无明显变化。此外，cAMP 升高可激活 Rac1，但不影响 RhoA 活性。
5. PG Ser⁶⁶⁵磷酸化对 cAMP 增强的内皮屏障黏附不重要：研究人员建立了 PG Ser⁶⁶⁵Ala 敲入小鼠来源的内皮细胞系，发现 cAMP 升高时，该细胞系的屏障完整性仍能显著增加，这表明 PG 在 Ser⁶⁶⁵位点的磷酸化对 cAMP 介导的内皮屏障增强作用并不关键。

研究结论与讨论

综合以上研究结果，研究人员发现 PG 虽然在调节细胞内 cAMP 浓度和 VE-PTP 表达方面有一定作用，但它及其在 Ser⁶⁶⁵位点的磷酸化对于 cAMP 介导的内皮屏障功能并非至关重要。PG 缺失会导致内皮屏障功能增强，这可能是通过多种补偿机制实现的，比如 VE-cadherin 和 β-catenin 的积累、PECAM-1 表达上调等。

这项研究为深入理解内皮屏障的调控机制提供了重要依据，打破了以往对 PG 在这一过程中作用的传统认知。它不仅有助于我们更全面地认识血管内皮细胞的生物学特性，也为相关疾病的治疗提供了新的潜在靶点和理论基础，为未来开发更有效的治疗策略指明了方向。