氯吡格雷治疗颈动脉狭窄的潜在分子机制研究：网络药理学与分子对接的新探索

本文通过网络药理学和分子对接技术，探究氯吡格雷治疗颈动脉狭窄的潜在分子机制，为临床应用提供理论依据。

　　

背景

颈动脉狭窄是动脉粥样硬化的一种表现，与多种心血管疾病风险增加相关。氯吡格雷作为广泛应用于预防和治疗动脉粥样硬化相关疾病的抗血小板药物，在急性冠状动脉综合征（ACS）和经皮冠状动脉介入治疗（PCI）中发挥重要作用，能有效降低支架血栓形成的发生率，改善患者预后。其主要作用机制是不可逆地结合血小板表面的 ADP 受体 P2Y₁₂，阻断 ADP 对腺苷酸环化酶的抑制，从而抑制血小板聚集。

然而，尽管氯吡格雷在临床治疗颈动脉狭窄中被广泛使用，但其具体的药理机制尚不明确。网络药理学和分子对接技术为探究药物作用机制提供了新的思路和方法。网络药理学整合了系统生物学、网络科学、计算生物学和传统药理学的原理和技术，通过分析生物系统内复杂的分子相互作用网络来研究药物的作用机制和疗效。分子对接则是一种计算化学方法，用于预测和分析小分子（如候选药物）与生物大分子（如蛋白质和核酸）之间的相互作用和结合模式，有助于深入理解药物分子与生物靶点的结合方式，预测潜在的药理机制。

方法

1. 氯吡格雷药物靶点筛选：在 PubChem 数据库中搜索 “Clopidogrel” 确定其标准结构和 SMILES 符号，基于此从 SwissTargetPrediction、ChEMBL 和 GeneCards 数据库收集潜在靶点。对搜索结果进行仔细审查和比对，确保结构一致性，整合并去重后，利用 UniProt 数据库对靶点名称进行标准化处理，构建氯吡格雷靶点库。
2. 颈动脉狭窄疾病靶点筛选：通过 GeneCards 数据库预测与颈动脉狭窄相关的靶基因，搜索 “Carotid artery stenosis” 并将结果导出到 Excel 表格，经过仔细审查、校准、去重，再利用 UniProt 数据库标准化靶基因名称，构建 “颈动脉狭窄” 靶基因库。
3. 氯吡格雷和颈动脉狭窄交集靶点筛选：运用 Venny 2.1.0 软件筛选氯吡格雷和颈动脉狭窄的交集靶基因，将重叠部分视为氯吡格雷治疗颈动脉狭窄的潜在药理靶基因，并通过下载 Venny 图像展示结果。
4. 构建蛋白质 - 蛋白质相互作用（PPI）网络和核心靶点筛选：把颈动脉狭窄和氯吡格雷潜在靶点的交集基因输入 STRING 数据库，限定物种为 “智人”，设置 “最小所需相互作用分数” 为 “中等置信度（>0.4）”，生成初始 PPI 图像和原始 STRING 数据。随后将原始数据导入 Cytoscape 软件（版本 3.10.2），选择合适的布局算法（如 “力导向” 或 “层次” 布局）组织网络结构，调整节点和边的样式，安装并启动 “NetworkAnalyzer” 插件计算拓扑参数，根据参数设置筛选标准确定核心靶点，最终生成可视化网络图表。
5. 靶蛋白的基因功能和通路富集分析：将从 PPI 网络图中筛选出的核心靶基因输入 DAVID 数据库进行基因本体（GO）和京都基因与基因组百科全书（KEGG）富集分析，设定 P<0.05 为显著性阈值。GO 富集分析涵盖生物过程（BP）、细胞成分（CC）和分子功能（MF），利用生物信息学平台可视化潜在相关的富集通路。
6. 分子对接：使用免费开源软件 Avogadro 设计氯吡格雷的结构并进行能量最小化和几何优化，保存为.pdb 格式。从结构生物信息学蛋白质数据库（PDB）获取核心蛋白的晶体结构，也保存为.pdb 格式，利用 DeepSite 数据库筛选和确定潜在结合位点。运用 AutoDockTools 1.5.6 软件对蛋白质进行处理，包括添加受体蛋白和小分子配体的 PDB 文件、引入氢原子、计算 Gasteiger 电荷并保存为.pdbqt 文件，设置对接盒大小为 40，调整对接结合位置，指定小分子配体的所有柔性键为可旋转，将受体蛋白设为刚性对接。执行 AutoGrid4 和 AutoDock4 获取对接结果并导出结合能，最后使用 PyMOL 软件导出蛋白质 - 配体复合物并保存为.pdb 文件，以便后续结果可视化。

结果与讨论

1. 氯吡格雷和颈动脉狭窄的交集靶点：在 GeneCards、SwissTargetPrediction 和 ChEMBL 数据库中校准和去重后，筛选出 250 个与氯吡格雷相关的靶点，从 GeneCards 数据库筛选出 2500 个与颈动脉狭窄相关的靶基因。通过 Venn 图分析，确定了 127 个氯吡格雷和颈动脉狭窄的交集基因。
2. PPI 网络和潜在靶点核心基因的筛选：利用 STRING 数据库构建初始 PPI 网络，将下载的 PPI 数据导入 Cytoscape 3.10.0 软件进行可视化和分析。使用 Cytoscape 软件中的 Centiscape 2.2 模块筛选出 25 个核心靶点，并构建相应的 PPI 网络。该网络由 25 个节点和 208 条边组成，节点颜色从浅黄色到深紫色表示节点度的增加。进一步筛选出 6 个关键核心靶点，分别为肿瘤坏死因子（TNF）、基质金属蛋白酶 9（MMP9）、前列腺素内过氧化物合酶 2（PTGS2）、趋化因子（C - C 基序）配体 2（CCL2）、Toll 样受体 4（TLR4）和白细胞介素 10（IL - 10）。
   • TNF：TNF 基因可促进炎症反应，增加内皮细胞中粘附分子的表达，吸引更多单核细胞进入血管壁，导致斑块形成和增大。血清 TNF - α 水平与颈动脉狭窄的严重程度相关，高水平的 TNF - α 与易损斑块相关，更易引发血栓和栓塞事件。
   • MMP9：MMP9 参与细胞外基质重塑，能降解斑块中的细胞外基质成分，如胶原蛋白和弹性蛋白，使斑块更易破裂，增加血栓形成风险。其表达与血管炎症、颈动脉斑块新生血管化程度正相关，与斑块弹性负相关，在颈动脉狭窄的发生、发展及并发症中可能起重要作用。
   • PTGS2：PTGS2 编码的前列腺素内过氧化物合酶 2（又称环氧化酶 2，COX - 2）是炎症过程中的关键酶，促进前列腺素的合成，参与炎症、疼痛和发热反应。在动脉粥样硬化发展过程中，PTGS2 的上调与颈动脉狭窄的炎症过程相关，还参与血管壁中脂质、胶原蛋白等细胞外基质成分的代谢，影响斑块的稳定性和易损性，抑制其活性可能有助于减缓颈动脉狭窄的进展。
   • CCL2：CCL2 又称单核细胞趋化蛋白 - 1（MCP - 1），是炎症和免疫反应中的关键趋化因子。它能吸引单核细胞进入动脉壁并分化为泡沫细胞，促进炎症细胞的迁移和激活，加剧血管壁的炎症反应。CCL2 表达增加与斑块不稳定和易损性相关，可能是治疗颈动脉狭窄的潜在靶点，抑制其活性或受体 CCR2 的信号传导可能有助于减缓病情进展。
   • TLR4：TLR4 作为模式识别受体，在免疫系统中发挥重要作用。其激活可促进炎症反应，而炎症是动脉粥样硬化的关键因素。在动脉粥样硬化斑块中，TLR4 的激活会增加炎症因子的表达，促进斑块发展和不稳定，还可能通过影响自噬过程参与动脉粥样硬化的发生发展。
   • IL - 10：IL - 10 是由 Th2 细胞、巨噬细胞等免疫细胞产生的抗炎细胞因子，能调节免疫反应，抑制炎症过程。它通过抑制促炎细胞因子（如 TNF - α、IL - 1β 和 IL - 6）的产生和减少免疫细胞激活发挥抗炎作用，对内皮细胞具有保护作用，可维持血管完整性，减少脂质浸润和炎症细胞粘附。IL - 10 水平的变化可作为评估颈动脉狭窄炎症状态和治疗效果的生物标志物。
3. 核心靶点的 GO 富集分析：对氯吡格雷治疗颈动脉狭窄的核心靶点进行 GO 功能富集分析，发现涉及 154 个生物过程（BP）、17 个细胞成分（CC）和 23 个分子功能（MF）。BP 结果显示，主要生物过程与对脂多糖（LPS）的反应密切相关。LPS 可激活 Toll 样受体（如 TLR4）促进炎症反应，炎症是动脉粥样硬化的关键因素。此外，血小板激活和血管生成也是与氯吡格雷治疗颈动脉狭窄相关的生物过程。血小板激活参与动脉粥样硬化的多个阶段，血小板参数与颈动脉狭窄相关；血管生成可能影响斑块稳定性，相关因子可作为颈动脉狭窄进展和患者预后的生物标志物。CC 结果表明氯吡格雷可能作用于细胞外区域、质膜外侧、细胞外空间和细胞外外泌体。MF 结果提示其分子过程可能包括蛋白酶结合、过氧化物酶活性、血红素结合和脂多糖结合。
4. 核心靶点的 KEGG 通路富集分析：将核心靶基因输入 DAVID 数据库进行 KEGG 通路分析，共富集到 86 条典型信号通路，选取 FDR 值最低的前 20 条通路进行分析。结果显示，氯吡格雷治疗颈动脉狭窄的信号通路最可能与脂质代谢和动脉粥样硬化密切相关。异常脂质代谢是动脉粥样硬化的主要危险因素，动脉粥样硬化的特征是动脉内膜病变，脂质和复杂碳水化合物积累，纤维组织增生和钙沉积形成斑块。颈动脉狭窄主要由动脉粥样硬化引起，控制血脂水平和改善脂质代谢对预防和治疗动脉粥样硬化及颈动脉狭窄至关重要。
5. 分子对接结果：通过分子对接分析氯吡格雷与 6 个核心靶基因（TNF、MMP9、PTGS2、CCL2、TLR4、IL - 10）的相互作用，使用 AutoDock 软件完成对接，结果显示结合能均小于 - 4.20 kcal/mol，表明氯吡格雷能与核心靶基因紧密结合，具有较强的亲和力，进一步证实了氯吡格雷在治疗颈动脉狭窄分子机制中的重要作用。最后利用 PyMOL 软件直观展示了氯吡格雷与核心靶点的结合细节。

结论

颈动脉狭窄是临床常见的血管疾病，氯吡格雷虽常用于治疗，但药理机制不明。本研究基于网络药理学筛选出 127 个交集靶点，确定 25 个核心靶点。GO 和 KEGG 富集分析表明，氯吡格雷可能通过调节炎症反应改善动脉粥样硬化症状，进而治疗颈动脉狭窄。分子对接技术显示氯吡格雷能紧密结合前 6 个核心靶点，进一步证明其通过调节这些靶点发挥治疗作用。尽管本研究缺乏临床数据验证，在一定程度上限制了深入探究，但炎症调节相关发现为未来研究提供了新的治疗策略，为氯吡格雷治疗颈动脉狭窄提供理论依据，有助于后续药物联合、新药研发和药理机制探索。