在氮限制条件下工程大肠杆菌中丙酮醇生物合成实现 NADPH 平衡

研究人员针对氮限制下工程大肠杆菌代谢问题，研究丙酮醇合成，发现其可平衡 NADPH，为代谢工程提供思路。

　　在生物制造的大舞台上，微生物就像一个个神奇的小工匠，承担着生产各种高价值化学品的重任。近年来，随着生物柴油产业的蓬勃发展，大量的甘油作为副产物被生产出来。甘油拥有独特的 “魅力”，它可以作为工业生物技术的碳源，为微生物的 “工作” 提供能量和物质基础。

在众多微生物中，大肠杆菌（Escherichia coli）凭借自身优势，成为利用甘油进行生物加工的潜力选手。丙酮醇（acetol）作为一种重要的工业原料，在化工、纺织、化妆品等多个领域都有着广泛的应用。利用大肠杆菌将甘油转化为丙酮醇，成为了科研人员关注的焦点。然而，在实际生产过程中，面临着诸多挑战。当以甘油作为唯一碳源进行丙酮醇生产时，细胞内的 NADPH 供应常常难以满足需求，成为高效生产丙酮醇的瓶颈。此外，在不同的营养条件下，大肠杆菌的代谢途径会发生复杂的变化，如何精准调控代谢流，提高丙酮醇的产量和生产效率，是亟待解决的问题。

为了攻克这些难题，来自德国亚琛工业大学（RWTH Aachen University）、丹麦技术大学（Technical University of Denmark）等研究机构的研究人员开展了一项深入研究。他们将目光聚焦在氮限制条件下，工程大肠杆菌利用甘油生产丙酮醇的代谢过程。通过一系列精心设计的实验，研究人员发现了氮限制与丙酮醇生物合成之间的紧密联系，这一发现为优化微生物细胞工厂，提高丙酮醇生产效率提供了新的思路，相关研究成果发表在《Microbial Cell Factories》杂志上。

研究人员在研究过程中，运用了多种先进的技术方法。其中，13^C代谢通量分析（13^C metabolic flux analysis）是关键技术之一。通过使用 2-13^C标记的甘油作为碳源，研究人员能够精确追踪细胞内代谢物的标记模式，从而深入了解碳通量在不同代谢途径中的分布和变化情况。此外，研究人员还采用了高效液相色谱 - 紫外检测（HPLC-UV）技术，对能量和氧化还原辅因子进行定量分析；利用气相色谱 - 质谱联用（GC-MS）技术，对细胞内、外代谢物以及氨基酸进行分析，这些技术为研究提供了丰富的数据支持。

研究结果主要包含以下几个方面：

• 氮限制触发丙酮醇生物合成：研究人员对工程化的丙酮醇生产菌株大肠杆菌 B4 进行了深入研究。在实验中，他们巧妙地设计了培养基的碳氮比，当氮源耗尽时，细胞生长停止，丙酮醇的生产却被启动。在指数生长期，细胞主要产生生物质、柠檬酸盐和二氧化碳，而在氮限制阶段，丙酮酸和丙酮醇成为主要产物。大肠杆菌 B4 达到了 1.63 g/L 的丙酮醇最大产量，产量为 0.53 mol_丙酮醇/mol_甘油^-1，生产力为 0.25 g_丙酮醇 L^-1 h^-1 （从氮限制开始约 6.5 小时内）或 0.06 g_丙酮醇 L^-1 h^-1 （包括生物质形成和氮限制阶段约 27 小时内）。同时，在氮限制下，细胞的代谢活性下降，甘油摄取率降低，丙酮酸作为主要副产物产生1。
• 代谢通量变化：在大肠杆菌利用 2-13^C甘油生长的过程中，研究人员通过 13^C代谢通量分析，详细研究了代谢通量的变化。在生长阶段，大部分碳通量流向糖异生途径（约 60%），产生的葡萄糖 - 6 - 磷酸部分用于生物质合成（44%），部分进入氧化戊糖磷酸途径（56%）合成 NADPH。而在氮限制阶段，代谢通量发生了显著变化，67% 的甘油通量从二羟基丙酮磷酸（DHAP）重新定向到丙酮醇生物合成，碳通量向糖异生途径的比例降至 22%。同时，通过中央碳代谢的通量减少，丙酮酸来自恩特纳 - 杜多罗夫（ED）途径的比例增加，进入三羧酸（TCA）循环的通量减少，细胞通过增加磷酸烯醇式丙酮酸（PEP）羧化酶等反应来补偿草酰乙酸（OAA）的需求23。
• NADPH 平衡的维持：研究人员进一步分析了氮限制条件下细胞内的辅因子浓度变化。他们发现，在向氮限制转变之前，NAD⁺的浓度为 3.39±0.11 μmol/g_CDW ，转变后迅速下降，1.5 小时后检测不到 NAD⁺ ，这表明在部分代谢过程中对 NAD⁺的需求过高。而 NADP⁺的浓度在氮限制阶段下降幅度较小，这意味着在将甲基乙二醛转化为丙酮醇的过程中，对 NADPH 的需求与氧化戊糖磷酸途径（PPP）中 NADPH 的再生反应达到了平衡。通过测量辅因子浓度和基于通量分析的生产 / 消耗速率这两种独立方法，研究人员得出结论，在氮限制条件下，细胞能够维持 NADPH/NADP⁺的平衡，而丙酮醇生物合成在这一过程中发挥了重要作用45。

研究结论和讨论部分指出，本研究揭示了氮限制条件下，工程大肠杆菌 B4 菌株从甘油生产丙酮醇的代谢机制。丙酮醇生物合成途径有助于维持细胞内的 NADPH/NADP⁺平衡，在氮限制且无生物质形成的条件下，细胞能够通过丙酮醇生物合成来有效调节 NADPH 浓度。尽管本研究中丙酮醇的最终产量低于先前报道，但生产时间缩短，生产力得到提高。此外，研究还发现了一些有待进一步研究和解决的问题。例如，在大肠杆菌 B4 生长过程中，柠檬酸盐在生长阶段作为副产物产生，丙酮酸在氮限制阶段积累，需要开发代谢工程策略来避免这些碳损失。未来，通过进一步优化代谢途径，如过表达甘油脱氢酶（GldA），有望实现 1,2 - 丙二醇的生产，但同时需要解决 NADH 供应不足等问题，还可能需要通过适应性实验室进化来提高菌株对高浓度产物的耐受性。

这项研究为利用微生物细胞工厂生产高价值化学品提供了重要的理论依据和实践指导，有助于推动基于甘油的可持续生物生产过程的发展，为实现更高效、更环保的生物制造目标迈出了坚实的一步。