一种基于半乳糖的自动表达系统可提高大肠杆菌中 T7 诱导的蛋白质产量

为解决大肠杆菌蛋白生产难题，研究人员开发自动表达培养基 BB，提升多种蛋白产量，推动生物技术发展。

　　在生物技术领域，蛋白质生产就像一座 “富矿”，吸引着无数科研人员去探索。其中，利用大肠杆菌生产蛋白质是现代生物技术的重要基石，而 T7 表达系统凭借其简单高效的特点，成为大肠杆菌蛋白质生产的 “主力军”。但这座 “矿山” 并非一帆风顺，在标准条件下，T7 表达系统面临着 scalability 和可重复性表达的挑战，尤其是对于某些特定的目标蛋白（POI），产量和质量都难以满足需求。就好比在一场赛跑中，T7 表达系统虽然起跑快，但跑到一半却遇到了各种障碍，无法顺利冲过终点。

为了攻克这些难题，来自美国蒙大拿大学（University of Montana）等机构的研究人员展开了深入研究。他们致力于开发一种新型的自动表达培养基，期望能够打破现有的生产瓶颈，提高蛋白质的产量和质量。经过不懈努力，研究成果发表在《Scientific Reports》上。

研究人员为开展此项研究，主要运用了以下关键技术方法：

1. 蛋白表达与检测技术：通过多种蛋白表达系统，如利用 eGFP 荧光监测、蛋白纯化和产量定量、免疫印迹等技术，分析不同培养基中蛋白的表达情况。
2. 共表达与活性验证技术：构建共表达系统，如人细胞色素 c（Hu-Cytc）与酵母血红素裂解酶的共表达，通过检测蛋白活性和产量，评估培养基性能。
3. 基因编辑技术：利用 CRISPR-Cas9 技术，将 SpCas9-siriusGFP 融合蛋白用于果蝇基因编辑实验，验证蛋白活性。

下面来详细看看研究结果：

1. BB 是生产 eGFP 的优质培养基：研究人员推测可以用 eGFP 荧光来衡量和监测使用 BB 的自动表达过程。为此，他们将表达 6xHis-eGFP 的大肠杆菌 BL21 (DE3) 细胞，在 BB、ThermoFisher’s MagicMedia?（MM）等多种培养基中培养。结果发现，BB 支持的细菌光密度（OD₆₀₀）与 TB、MM 和 ZYM 相近，但 eGFP 荧光强度却显著更高。进一步研究表明，BB 能产生更多 eGFP，且细胞内荧光可用于监测和优化自动表达过程中的蛋白生产，这是因为 BB 中蛋白的折叠效率更高，有助于提高目标蛋白产量。
2. BB 提高双表达系统的效率：在具有挑战性的共表达场景中，研究人员选择 Hu-Cytc 作为模型，它需要与酵母血红素裂解酶同时表达。以往使用 TB 或 2xYT 培养基时，30 - 40% 的培养物无法表达 Hu-Cytc。而在 BB 中，12 个培养物均成功表达，且产量约为 2xYT 的三倍。对纯化的 Hu-Cytc 进行检测发现，其具有与之前报道数据一致的酶活性参数，这表明 BB 能可靠地生产有活性、功能正常的酶。
3. BB 在双表达系统中维持更多产生目标蛋白的细胞：为探究 BB 在双表达系统中的优势机制，研究人员使用流式细胞术和由 mStayGold 绿色荧光蛋白和 mTagBFP2 蓝色荧光蛋白组成的荧光双表达系统。结果显示，BB 产生的双荧光细胞数量比 LB 和 TB 多 10 倍，且双阳性细胞中每个荧光团的平均荧光强度在三种培养基中相似，在 BB 中还有所增加。这说明 BB 能支持更多细胞同时产生两种目标蛋白，且表达更均衡。
4. BB 使用半乳糖作为诱导剂生产天然折叠的富含二硫键的蛋白质：BB 依赖半乳糖诱导 T7 系统，研究人员通过在不同大肠杆菌菌株中测试，发现半乳糖能诱导 T7 表达系统，且在 SHuffle T7 Express 菌株中与 IPTG 诱导效果相当。利用该系统，研究人员成功生产并结晶了 GluN1 和 GluN2A 亚基的激动剂结合域（ABD），晶体结构显示其具有正确的二硫键配对，这为后续研究含二硫键蛋白提供了有力支持。
5. BB 增加重组 SpCas9 的产量：研究人员验证了 BB 用于生产关键蛋白 SpCas9 的效果，通过表达 SpCas9-siriusGFP 融合蛋白，观察到 siriusGFP 的积累。与之前报道的产量相比，使用 BB 后，纯度大于 95% 的 apo-SpCas9 产量提高了 8 倍。
6. BB 产生的 SpCas9 在体内具有催化活性：研究人员通过靶向果蝇的 ebony 基因，验证了 BB 表达的 SpCas9-siriusGFP 的活性。结果显示，注射 SpCas9/sgRNA 复合物后，部分果蝇出现体细胞镶嵌表型，且部分存活果蝇能够将编辑传递给后代，这表明 BB 生产的 SpCas9 具有体内催化活性。

研究结论和讨论部分指出，该研究开发的自动表达肉汤（BB）在重组蛋白生产方面具有显著优势。它无需添加急性诱导剂，就能提高多种重组蛋白的产量，包括 eGFP、人细胞色素 c 等，在与其他常用培养基的比较中表现优异。BB 不仅能支持高细菌培养密度，还能使目标蛋白更多地存在于可溶部分，提高折叠效率。在复杂的共表达过程中，BB 的成功率更高，且能有效生产含二硫键的蛋白，拓展了其在药物发现和结构生物学领域的应用潜力。此外，BB 在生产高纯度、高活性的 SpCas9 方面效果显著，这对于加速基因编辑研究和临床应用具有重要意义。总之，Bosco Broth（BB）为大肠杆菌蛋白生产领域树立了新的标杆，为学术研究和工业生物技术带来了新的机遇。