综述：枯草芽孢杆菌表面展示技术：生物加工和可持续制造中的应用

枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）表面展示技术在多领域应用广泛，潜力巨大，本文全面综述其进展。

　　

枯草芽孢杆菌表面展示技术：生物加工和可持续制造中的应用

在当今生物科技蓬勃发展的时代，微生物生物技术已成为推动现代工业进步的重要力量，其中枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）作为一种极具潜力的微生物，备受科研人员关注。

1. 枯草芽孢杆菌概述

枯草芽孢杆菌是革兰氏阳性菌，被美国食品药品监督管理局（FDA）认定为 “一般认为安全”（GRAS）的微生物。它具有易于遗传改造、蛋白质分泌能力强、能形成内生孢子等特点，这些特性使其在工业、农业和医学等领域广泛应用，可用于生产工业酶、生物燃料、疫苗成分等多种高价值产品，为生物技术发展贡献巨大。

2. 表面展示技术原理

表面展示技术是将肽和蛋白质附着在微生物细胞表面的分子技术，常用的表面展示系统包括噬菌体、酵母、原核细胞和细菌孢子等，它们依靠特定表面蛋白作为锚定物来展示目标蛋白。枯草芽孢杆菌的表面展示技术独具优势，分为细胞表面展示和孢子表面展示两种方式。

• 细胞表面展示：利用细菌细胞壁，在营养生长阶段将目标分子展示在细胞表面，参与展示的蛋白有跨膜蛋白、脂蛋白等多种类型。由于营养细胞具有代谢活性，该展示系统适用于连续催化、生物传感和治疗化合物的精准递送等动态应用，但需要严格控制条件以维持细菌活力。
• 孢子表面展示：通过将目标蛋白与孢子外壳蛋白融合，在孢子形成过程中将其整合到孢子外壳。孢子外壳具有出色的耐久性，能抵御热、脱水和化学暴露等环境挑战，使孢子展示平台适合长期稳定的应用，如疫苗接种、酶稳定化和极端环境下的生物传感，且能确保目标蛋白功能和可及性。

3. 在微生物细胞生物加工中的应用

• 酶固定化用于工业催化：酶固定化技术对提高酶的稳定性、扩大商业应用和提升经济潜力意义重大。传统酶固定化方法各有优缺点，而枯草芽孢杆菌表面展示系统为酶固定化提供了可持续的替代方案。它能通过与特定展示基序融合，将酶锚定在细菌细胞或孢子上，不仅保持酶对底物的可及性，还能保护酶免受恶劣条件影响，便于从反应混合物中分离生物催化剂，优化酶的回收和再利用。例如，研究人员利用枯草芽孢杆菌展示多种酶，如外切几丁质酶（PbChiA）、木质素过氧化物酶（LiP）等，这些酶在展示后展现出良好的稳定性、活性和可重复性，在生物燃料生产、食品加工等多个领域展现出广阔的应用前景。
• 环境应用：在环境污染问题日益严峻的当下，枯草芽孢杆菌表面展示技术在环境生物技术领域展现出巨大潜力。通过工程改造，枯草芽孢杆菌可在表面或孢子上展示污染物降解酶或结合蛋白，有效靶向和降解环境污染物。例如，在有机磷污染治理方面，研究人员开发的枯草芽孢杆菌孢子展示系统可展示有机磷水解酶（OPH）和有机磷酸酸酐酶（OPAA），实现对有机磷污染物的高效降解；在卤代化合物污染修复中，展示卤代烷脱卤酶（HLD）的枯草芽孢杆菌孢子可有效降解卤代污染物；在重金属污染处理方面，表面展示金属结合蛋白的枯草芽孢杆菌孢子能吸附重金属离子，实现重金属的去除和回收，为环境修复提供了新的解决方案。
• 生物传感器用于监测生物过程：生物传感器能将生物响应转化为电信号，具有高特异性、不受 pH 和温度影响、可重复使用等优点，在食品安全、临床检测和环境监测等领域应用广泛。枯草芽孢杆菌凭借其强大的生产力、高产量和展示大目标分子的能力，成为生物传感器开发的理想平台。通过表面展示技术，可将受体蛋白或酶展示在细菌表面，用于检测特定化学或生物信号。如 “Sposensor” 利用基因工程改造的枯草芽孢杆菌固定化孢子，能快速检测金属离子和抗生素；基于绿色荧光蛋白（GFP）的全细胞生物传感器（WCB-GFP）可特异性检测砷，为环境监测提供了高效工具。

4. 在生物制造中的应用

• 疫苗生产：利用活细菌作为疫苗递送平台是疫苗开发的重要策略，枯草芽孢杆菌在疫苗生产中优势显著。它可表达抗原，通过鼻内或舌下给药，为黏膜疫苗开发提供新方向，能有效激发系统免疫和黏膜免疫反应。抗原在枯草芽孢杆菌上的展示方式多样，包括在营养细胞表面展示、孢子表面重组展示和非重组吸附展示，每种方式各有优劣。目前，基于枯草芽孢杆菌的疫苗已针对多种病原体进行开发，如新冠病毒、流感病毒、结核杆菌等，部分疫苗已进入临床前或早期临床试验阶段。
• 治疗蛋白生产和递送系统：枯草芽孢杆菌是高效的蛋白表达宿主，通过遗传工程和表面展示技术，可在细菌细胞或孢子表面表达治疗蛋白，简化下游加工过程，相比传统哺乳动物细胞培养方法，成本更低且可扩展性更强。例如，展示几丁质酶（ChiS）的枯草芽孢杆菌孢子可抑制真菌病原体生长；此外，枯草芽孢杆菌还可作为口服药物递送载体，其孢子能保护药物免受胃酸降解，确保药物在肠道精准释放，提高药物稳定性和生物利用度，在癌症治疗等领域展现出巨大潜力。
• 在药物发现和高通量筛选（HTS）中的作用：微生物系统在解决工业和社会问题方面发挥着重要作用，但因其复杂性，常需组合方法优化。HTS 具有微型化、高效和自动化的优势，在抗菌药物发现中至关重要。枯草芽孢杆菌无论是作为完整细胞还是孢子形式，都能显著提高蛋白质、抗体和肽库筛选效率，加速药物发现进程。通过在其表面展示多样化的分子，可快速筛选与疾病相关靶点的相互作用，结合先进的分选技术，能有效识别具有强结合亲和力的候选分子，推动新型治疗和诊断分子的开发。

5. 挑战与机遇

尽管枯草芽孢杆菌表面展示系统前景广阔，但仍面临诸多挑战。在孢子展示系统中，合适载体蛋白的选择至关重要，它影响表面展示蛋白的稳定性；此外，孢子表面展示的蛋白表达水平较低，限制了其工业应用，优化表达水平、解决蛋白稳定性和折叠问题以及设计合适的连接子是关键所在。同时，微生物工程中还存在蛋白降解和细胞自溶等问题，不过通过使用蛋白酶缺陷型菌株、化学蛋白酶抑制剂等方法可在一定程度上解决。未来，可通过利用计算工具和 HTS 方法设计新型连接子，开发更强力的启动子，以及探索更多的锚定蛋白等策略，进一步优化枯草芽孢杆菌表面展示系统。

6. 结论

枯草芽孢杆菌表面展示技术利用孢子和营养细胞形式，为生物技术应用提供了多功能平台。孢子系统凭借其稳健性和稳定性，在酶生物催化、环境生物传感器、黏膜疫苗和药物递送系统中表现出色；营养细胞则在实时治疗蛋白生产和代谢工程中发挥重要作用。未来研究应结合合成生物学、计算建模和 HTS 等技术，充分发挥两种系统的优势，推动生物加工和生物制造领域的创新发展，为全球医疗保健和环境可持续性做出更大贡献。