综述：木糖醇：假丝酵母属生产的一种有前景的甜味剂

本文综述了假丝酵母属生产木糖醇的生物技术，探讨其应用、优势、挑战及研究进展。

　　

木糖醇：假丝酵母属生产的一种有前景的甜味剂

引言

木糖醇（C5?H12?O5?）是一种糖醇类物质，它具有独特的优势，甜度与蔗糖相当，但热量更低（2.4 vs. 4 cal/g），升糖指数也较低，适合用于低热量产品和糖尿病患者的饮食。这是因为它可以在不依赖胰岛素的情况下被人体吸收，有效避免了血糖的大幅波动。此外，木糖醇还具有预防龋齿的功效，能使成年人龋齿减少 85%，原因在于致龋细菌无法代谢木糖醇，因此它常被添加到牙膏和漱口水等口腔护理产品中。在医疗领域，木糖醇鼻溶液可用于预防和治疗骨质疏松、溶血性贫血、急性中耳炎、鼻窦炎和呼吸道炎症等多种疾病。同时，木糖醇还可用于生产木糖酸、二醇、羟基呋喃、聚酯树脂、PET 瓶、油漆和涂料等，被视为一种潜在的低成本石化替代品，具有广阔的市场前景。

全球木糖醇市场发展迅速，2018 年其市场价值为 8.236 亿美元，预计到 2025 年将达到 13.7 亿美元，其中口香糖行业是推动市场增长的主要力量。杜邦、三菱商事和嘉吉等供应商在市场中占据主导地位。然而，目前木糖醇的生产主要依赖化学方法，这种方法存在诸多弊端，如成本高昂、对环境造成破坏等。因此，研究人员积极探索替代方法，生物技术生产木糖醇应运而生，其中利用酵母生产木糖醇成为研究热点。

在众多酵母中，酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）是研究较为深入的真核微生物，但它无法代谢木糖。而假丝酵母属（Candida sp.）则具有高效将木糖转化为木糖醇的能力，并且对酸性条件和高温具有较强的耐受性，部分菌株的木糖醇产量可超过 80%，所以在木糖醇生产中得到广泛应用。本文将深入探讨利用假丝酵母属生产木糖醇的关键方面，包括生产方法、优化策略以及相关的益处和挑战。

木糖醇的生产

1. 化学合成法：工业上通常采用在高温高压下，以金属催化剂（如雷尼镍）对木糖进行化学还原的方法来合成木糖醇。首先，对木质纤维素生物质进行水解，将半纤维素分解为单体糖，从而得到富含木糖的水解产物。接着，通过活性炭和离子交换色谱等方法对水解产物进行纯化，去除不需要的副产物和水解残留物，以实现脱色和去除抑制剂的目的。然后，在 353 - 413K 的温度和高达 5MPa 的氢气压力下进行木糖氢化反应，之后再经过纯化、浓缩和结晶等步骤，最终获得木糖醇。虽然该方法的结晶过程能够实现超过 75% 的产率和 98% 以上的纯度，但它存在明显的缺点，如能耗高、需要高压条件，且催化剂敏感性强，这些因素都导致了生产成本的增加。
2. 酵母生物合成法：细菌、丝状真菌和酵母都能产生木糖醇，目前大多数研究集中在假丝酵母属。在酵母中，木糖还原酶（XR）是将半纤维素糖转化为木糖醇的关键酶，它能将 D - 木糖还原为木糖醇。随后，木糖醇脱氢酶（XDH）会将木糖醇氧化为 D - 木酮糖，D - 木酮糖再由木酮糖激酶转化为木酮糖 5 - 磷酸，进而进入戊糖磷酸途径。XDH 需要NAD+作为辅酶，而 XR 则使用 NAD (P) H，因此木糖同化的效率取决于 XR 和 XDH 的活性。

在低氧条件下，由于 NADH/NAD+的氧化还原失衡，XDH 活性会因NAD+短缺而降低，从而导致木糖醇积累。这是因为在这种情况下，氧化磷酸化无法重新氧化所有的 NADH，使得 XR 活性增强，促进了木糖醇的积累。不同的假丝酵母属菌株，其 XR 对辅酶的依赖有所不同。例如，热带假丝酵母（C. tropicalis）的 XR 既依赖 NADPH，也依赖 NADH，而季也蒙假丝酵母（Candida guilliermondii）的 XR 则严格依赖 NADPH。因此，季也蒙假丝酵母会积累乙酸来再生 NADPH，而热带假丝酵母则利用戊糖磷酸途径中的果糖 - 6 - 磷酸。此外，为了再生NAD+，这两种菌株都会产生少量的甘油和乙醇等副产物，这些副产物作为氧化还原消耗物，有助于维持 XDH 的活性。

在有氧条件下，理论最大产率不受辅酶类型的影响，使用NADPH2+时，每消耗 1mol 木糖可产生 0.9mol 木糖醇；使用NADH2+时，产率为 0.905mol/mol。总的有氧反应方程式为：。在厌氧条件下，理论最大产率为每消耗 1mol 木糖产生 0.875mol 木糖醇，反应方程式为：。

影响假丝酵母属生产木糖醇的因素

1. 氧气供应：氧气供应对木糖醇的生产至关重要。在合成培养基和半纤维素水解产物中，氧气供应的影响都有研究，但由于测量方法的差异，使得结果比较变得复杂。微需氧条件能够优化木糖醇的生产，这是因为在这种条件下，NAD+得以再生，同时还能产生细胞生长和 XR 活性所需的 ATP 和 NADPH。
2. 初始木糖浓度：初始木糖浓度对木糖醇的生产影响显著。较低的木糖浓度有利于生物量的增长，但会降低木糖醇的产率；而过高的木糖浓度则会因渗透压问题导致产率下降。
3. 碳氮比和氮源：碳氮比和氮源也会对木糖醇的生产产生影响。较低的碳氮比促进生物量的形成，而较高的碳氮比则有利于代谢产物的合成。
4. 温度和 pH 值：温度是影响木糖醇生产的另一个关键因素，嗜温酵母在适宜温度下表现最佳。当温度高于 45°C 时，木糖醇的产率会降低，这可能是由于 XR 辅酶失活所致。酵母通常在 pH 4 - 6 的环境中生长，不同的假丝酵母属菌株对 pH 值的偏好有所不同，如近平滑假丝酵母（Candida parapsilosis）和季也蒙假丝酵母在 pH 6 时生长良好，而热带假丝酵母则能在 pH 2.5 - 4.5 的环境中耐受。

微生物的活性和木糖醇的生产还受到培养条件的控制。为了提高木糖醇的产率、生产率和产品浓度，可以采用培养基设计、发酵过程调整和基因改造等优化策略。

木糖醇生产的培养方式

1. 分批培养：在分批培养中，培养基的所有成分和接种物仅在发酵试验开始时添加，发酵结束时收集细胞内或细胞外的产物。在整个试验过程中，通常会控制 pH 值、温度和溶解氧等条件，使其保持恒定。研究表明，使用热带假丝酵母进行分批培养生产木糖醇时，底物产率（YP/S?）范围为 0.53 - 0.93 g/g，木糖醇最终浓度在 49 - 172 g/L 之间。值得注意的是，雅典假丝酵母（C. athensensis）在酵母提取物培养基中，以 250 g/L 的初始木糖浓度进行培养，可获得 207.8 g/L 的木糖醇。关于产物的体积生产率（QP?），其值在 0.2 - 3.86 g/Lh 之间变化。
2. 补料分批培养：补料分批培养过程中，持续添加生长和产物形成所必需的营养物质，在发酵结束时回收产物。只要细胞保持活力和生产能力，这个过程就可以多次重复。研究显示，在假丝酵母属的补料分批培养生产木糖醇中，碳源的进料方式有所不同，包括脉冲进料和恒定流量进料以维持初始浓度，同时使用木糖和葡萄糖来优化木糖醇的生产。与分批培养实验相比，补料分批培养的产率和生产率都有所提高，YP/S?值达到 0.68（g/g），QP?值为 0.97（g/Lh）。
3. 其他培养方式：除了分批培养和补料分批培养，连续培养和循环培养也在研究之中。连续培养能够在较长时间内保持较高的生产率，但存在一些问题，如容易诱导突变、细胞污染以及在系统管道中积累等。虽然离心可以提高细胞浓度和产率，但大规模应用时成本高昂且容易受到污染。相反，Kwon 及其合作者开发了一种基于浸没式膜生物反应器的细胞循环系统，利用抽吸压力和空气喷雾来实现细胞循环。此外，固定化酵母也被用于木糖醇生产的研究，使用搅拌罐、鼓泡塔和填充床反应器等不同类型的生物反应器，但由于氧气传递受限，总体效率并未显著提高。

基因工程在木糖醇生产中的应用

尽管在发酵过程中，天然的假丝酵母属菌株能够实现较高的产率和生产率，但在工业规模的木糖醇生产中，它们仍面临一些限制。高浓度的产物、初始底物水平、对木质纤维素生物质水解产生的抑制剂的抗性以及副产物的形成等因素，都会抑制细胞的生长和生产率，同时也增加了产物纯化和分离的难度。

为了克服这些问题，研究人员尝试通过基因工程手段来提高木糖醇的产量。例如，通过过表达天然酶或异源插入来增强 XR 酶的活性。使用组成型甘油醛 3 - 磷酸脱氢酶启动子，在热带假丝酵母突变株中过表达来自粗糙脉孢菌（Neurospora crassa）的密码子修饰的 XR 基因，可使木糖醇生产率分别提高 35% 和 73%。将近平滑假丝酵母（C. parapsilosis）的 XYL1 基因插入热带假丝酵母中，与亲本菌株相比，木糖醇、乙醇和甘油的产量并未出现差异。

为了降低 XDH 活性，防止木糖醇被氧化，研究人员对热带假丝酵母中编码 XDH 的 XYL2 基因进行了删除。突变菌株在以木糖为唯一碳源的矿物培养基中生长时，需要甘油作为共底物。该突变菌株将木糖转化为木糖醇的生产率为 3.23 g/Lh，产率为 0.98，并积累木酮糖。此外，通过沉默 XYL2 基因的一个拷贝并在辅酶结合区域引入点突变来降低 XDH 活性，可使YP/S?产率从 0.62 提高到 0.75，但突变菌株的生长速度会变慢。另外，通过增加 NADPH 的可用性来增强 XR 活性，在缺乏 XDH 基因的热带假丝酵母 BSXDH - 3 中，过表达编码葡萄糖 - 6 - 磷酸脱氢酶和 6 - 磷酸葡萄糖酸脱氢酶的 ZWF 和 GND 基因，由组成型甘油醛 3 - 磷酸脱氢酶启动子驱动，与 BSXDH - 3 相比，使用甘油作为共底物时，生产率提高了 21%。

随机诱变和靶向修饰在开发具有降低 XDH 活性的热带假丝酵母菌株中发挥了关键作用。EMS 诱变的热带假丝酵母 K2M 菌株木糖醇产量提高了 9.2%，而杂合 XYL2 菌株 K21D 与亲本菌株相比，木糖醇产量提高了 16%，并且在木糖醇 - 乙醇生物炼制过程中无需共底物。这种基因修饰涉及改变 XYL2 基因的一个等位基因（XYL2δ::FRT），从而降低木糖醇脱氢酶活性，提高木糖醇产量。

近年来，研究方向逐渐从使用纯木糖转向可再生来源，如木糖母液（XML），它是木糖纯化过程中的副产物，含有木质纤维素生物质水解产生的有毒化合物，会阻碍木糖醇的生产。在热带假丝酵母 XZX - B4ZG 中，删除编码 XDH 的 XYL2 基因以阻止木糖醇转化为木酮糖，并通过表达来自解脂耶氏酵母（Y. lipolytica）的 YlZWF、YlGND 和 YlMAE 基因引入 NADPH 再生系统。修饰后的菌株在 5L 发酵罐中，以 300 g/L 的 XML 为底物，在 120 小时内产生了 97.10 g/L 的木糖醇，转化率达到 92.40%，对 XML 抑制剂表现出较高的耐受性。然而，为了维持细胞内 NADPH 水平，增强 XR 酶活性，该过程使用了葡萄糖作为共底物。

目前，CRISPR/Cas9 基因组编辑技术尚未直接应用于假丝酵母属菌株的开发。虽然已在酿酒酵母中过表达热带假丝酵母的 XR 酶基因，使用葡萄糖作为共底物时，实现了 0.83 g/Lh 的木糖醇生产率和 0.99 g/g 的产率。此外，该技术已在产甘油假丝酵母（Candida glycerinogenes）中得到开发，但主要应用于乙醇和木糖酸的生产。这凸显了在将这一新兴技术应用于非传统酵母（如假丝酵母属）方面存在研究空白。一方面，对于酿酒酵母等模式生物，存在更标准化的实验方案，而对于假丝酵母属则相对缺乏；另一方面，假丝酵母属的一些物种具有二倍体甚至多倍体基因组，这增加了基因编辑的难度。不过，随着基因工程工具的不断发展，未来该技术有望应用于假丝酵母属酵母的木糖醇生产。

木糖醇生产的动力学模型和系统生物学研究

1. 动力学模型：数学模型是研究假丝酵母属生产木糖醇的重要方法，它可以评估发酵参数，预测关键因素，如生长速率、产率、浓度和维持系数等，还有助于分析发酵的稳定性。第一个用于分析假丝酵母属生产木糖醇的动力学模型采用非结构化方法，对分批培养进行了两个阶段的分析。在阶段 A，由于底物过量，微生物达到最大比生长速率（μmax?）；在阶段 C，氧气传递限制了微生物的生长。在阶段 A，木糖醇被消耗而不积累，在阶段 C，木糖醇随着生长而产生。不同通气条件（0.1 - 0.5 vvm）下的实验数据表明，该模型能够准确地描述变量，在 0.1 vvm 时，YP/S?值最高。

Monod、Contois 和 Tessier 模型则用于评估季也蒙假丝酵母的生长和底物消耗情况。这些模型通过结合μmax?和饱和常数，确定了细胞质量的形成和底物的利用。在测试条件下，Contois 模型的标准偏差最小，被证明是最可靠的。Kim 等人开发了一个模型来描述热带假丝酵母 13,803 的生长和木糖转化过程，并优化了初始葡萄糖浓度。该模型使用 Luong 方程将乙醇浓度与生长速率相关联，对分批培养数据进行拟合。模型验证显示，木糖醇生产率为 5.06 g/Lh，与预测值非常接近。另外，还有一个预测热带假丝酵母 mogii 生物量、葡萄糖、木糖和木糖醇浓度的模型，包含 11 个参数。虽然该模型与木糖消耗趋势相符，但培养 10 小时后的木糖醇浓度高于实验数据。一个基于初始木糖和氧气浓度与搅拌相关的动力学参数，建立的非结构化动态动力学模型，用于描述热带假丝酵母的木糖醇生产和生长过程。尽管实验和模型预测的发酵曲线表现出相似的行为，但除了在 100 g/L 木糖浓度下误差在 4 - 10% 之间（木糖醇浓度误差为 17%）外，其他情况下误差均超过 15%。近年来，使用热带假丝酵母 TISTR 5306 开发了一种木糖醇生产的共底物模型，该模型结合了修改后的 Monod 方程来考虑底物限制和抑制作用，在不同木糖浓度（10 - 100 g/L）和葡萄糖水平（1 - 10 g/L）下，与实验数据拟合良好（平均 RSTotal 为 162，R2为 0.979）。该模型成功应用于预测未解毒玉米芯半纤维素水解产物的木糖醇产量，与实验结果高度吻合（RSTotal 为 368，R2为 0.988）。2. 系统生物学：系统生物学通过定量和定性方法研究生物体的特性和相互作用，将实验数据与数学模型相结合。它整合了组学数据（基因组学、转录组学、蛋白质组学和代谢组学），以了解细胞和生物体的生长、适应和发育过程。在木糖醇生产方面，已有研究对整体和特定表达进行了分析。热带假丝酵母对木糖的转运是研究的重点之一。通过计算分析和基因表达研究，在热带假丝酵母的基因组框架内识别并表征了 11 个候选木糖转运蛋白，其中 CtXUT1 在木糖摄取高峰（21 - 36 小时）期间表达量最高。研究结果表明，CtXUT1 是关键的转运蛋白，尤其是在木糖作为主要碳源的条件下，其木糖消耗速率可达 1.02 g/L/h。这表明优化木糖转运蛋白可能显著提高木糖醇的生产效率。此外，研究还发现 pH 值的变化会影响该基因的表达水平，较高的 pH 值可能会降低其效率，这突出了 pH 值控制在调节热带假丝酵母木糖转运和代谢中的关键作用。

对中间假丝酵母（C. intermedia）的基因组和转录组研究，使人们<继续深入了解了其遗传结构以及将木糖代谢为具有商业价值产品（如木糖醇）的能力。对两个不同菌株 cbs 141442 和 pycc 4715 的基因组进行检查后发现，它们在大小（13.1 - 13.2 mbp）和蛋白质编码基因数量（5936 - 6073 个基因）上具有显著相似性。尽管如此，每个菌株仍存在独特的基因组改变，包括易位，同时染色体结构大部分保持保守。此外，基因组和转录评估揭示了几种木糖还原酶的存在，其中一种对 nadh nadph>

热带假丝酵母对木质纤维素生物质水解过程中产生的抑制剂具有显著抗性。初步的特定表达研究证实，乙醇脱氢酶 1 基因（alcohol dehydrogenase 1 gene，ADH1）在糠醛存在时会上调，这突出了其在解毒过程中的关键作用。糠醛耗尽后，ctADH1 转录会被乙醇抑制，以维持氧化还原平衡。了解热带假丝酵母对糠醛耐受性的分子机制，对于优化木糖发酵过程至关重要。

通过定向进化，热带假丝酵母菌株对木质纤维素生物质水解产生的抑制性化合物的耐受性得到了提高。从亲本菌株 Y - 3 衍生的热带假丝酵母 Y31 - N 菌株，木糖醇产量增加了 84.8%，糠醛消耗速率提高了 5 倍。这种性能的提升归因于通过脂肪酸变化调节细胞膜流动性，使细胞在糠醛胁迫下仍能维持膜功能的完整性。此外，该菌株还表现出快速的 ATP 和 NAD (P) H 生成，代谢组学分析表明代谢重排是其关键响应机制。另外，对热带假丝酵母 SHC - 03 针对玉米秸秆水解产生的抑制性化合物的耐受性进化进行了逐步进化研究。经过 60 代进化后，得到的 GB - 60 菌株对乙酸、苯酚和糠醛等抑制剂具有更强的耐受性，亚细胞损伤也有所减少。对 GB - 60 菌株和其亲本 SHC - 03 菌株进行比较转录组学和基因组分析后发现，与细胞壁生物合成和重塑、戊糖磷酸途径、抑制性化合物解毒以及多药 / 多异生物质抗性转运蛋白相关的关键基因出现了过表达和突变。这些结果为开发更优良的菌株以优化木质纤维素生物质发酵奠定了基础。

在代谢组学方面，研究了热带假丝酵母 SHC - 03 对玉米秸秆水解产物中有毒副产物的响应。结果观察到，该菌株积累了 84.61% 的活性氧物种，线粒体受到损伤，生长受到 40% 的抑制。在代谢方面，谷胱甘肽和硫氧还蛋白系统被激活，麦角甾醇生物合成和膜厚度增加，转运蛋白和醛还原酶的表达也上调，这些都有助于提高对抑制剂的耐受性。此外，通过对水解产物的代谢组学分析，鉴定出了 1469 种物质，包括糖、醛、酸和酚类，这些物质可能会影响酵母的生长抑制。在细胞水平上，热带假丝酵母 SHC - 03 积累活性氧物种并维持内质网稳态。与谷胱甘肽还原、麦角甾醇、泛醌 - n 生物合成、错误折叠蛋白降解和脂肪酸相关的基因被发现上调，这表明这些机制是对水解产物中抑制细胞生长和存活的副产物进行解毒的响应。

结论

木糖醇具有诸多健康益处，适合糖尿病患者食用，能预防龋齿，还可减少耳部感染。目前，木糖醇生产的研究主要集中在基于酵母的生产过程，特别是热带假丝酵母和季也蒙假丝酵母，与化学方法相比，它们具有更高的效率和更低的环境影响。尽管如此，工业规模生产仍面临细胞生长抑制和副产物生成等挑战。过表达 XR 基因已显示出提高木糖醇产量的潜力，这表明基因改造可能是提高工业生产效率的有效途径。持续的研究以及产学研合作对于克服木糖醇生产中的挑战至关重要，有望推动木糖醇产业的进一步发展，使其在食品、医药和化工等领域得到更广泛的应用。